梁晶晶，劉寶同，武夢(mèng)君，馮海霞，張大偉,3*

（1.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東青島 266111；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266237；3.齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種益生菌，在動(dòng)物腸道內(nèi)通過(guò)代謝和增殖能夠調(diào)節(jié)腸道菌群、改善機(jī)體消化能力、提高免疫力和抗病力。在水體中可通過(guò)生物同化作用提升水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫等有害物質(zhì)的凈化效率[1-3]?？莶菅挎邨U菌作為一種微生態(tài)制劑，在生產(chǎn)、加工和運(yùn)輸過(guò)程中往往以孢子形式存在，在腸道和水體中必須由芽孢萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)體，在繁殖代謝階段才能發(fā)揮益生作用。而關(guān)于枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖水環(huán)境下的真實(shí)萌發(fā)情況鮮有報(bào)道。

枯草芽孢桿菌近緣種群包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）等10 余種[4]。枯草芽孢桿菌又分為多個(gè)亞種，包括枯草亞種（B.subtilis subsp.subtilis）、納豆亞種（B.subtilis subsp.Natto）、斯 氏 亞 種（B.subtilis subsp.spizizenii） 和 沙 漠 亞 種（B.subtilis subsp.inaquosorum）等[4-5]。NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示，截止2018 年發(fā)表的枯草芽孢桿菌亞種達(dá)到14 種。由于枯草芽孢桿菌各亞種間生理性能有一定差異，本文就納豆亞種、枯草亞種和沙漠亞種3 個(gè)亞種的萌發(fā)情況進(jìn)行初步探究，以期為芽孢桿菌在水質(zhì)改良中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 枯草芽孢桿菌枯草亞種K91 噴霧干燥菌粉、納豆亞種N66 噴霧干燥菌粉、沙漠亞種S03 噴霧干燥菌粉是將3 個(gè)亞種的發(fā)酵液以輕質(zhì)碳酸鈣為載體通過(guò)相同的噴霧干燥工藝分別獲得常規(guī)菌粉制劑，均由青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司提供。

LB（ Luria-Bertani）培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨、5 g 酵母提取物、5 g NaCl，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4，用去離子水定容至1 L，高壓蒸汽121℃滅菌20 min。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司，稱取33 g 瓊脂于1 L 去離子水中，高壓蒸汽121℃滅菌20 min。

葡萄糖玉米粉培養(yǎng)基：15 g 葡萄糖、17 g 玉米粉，去離子水1 L，高壓蒸汽121℃滅菌20 min。

草酸銨結(jié)晶紫染液：A 液為結(jié)晶紫2 g，95%乙醇20 mL；B 液為草酸銨0.8 g，蒸餾水80 mL；混合A、B 二液，靜置48 h 后使用。

萌發(fā)劑：AGFK（A ：L- 天冬酰胺100 mmol/L；G：葡萄糖10 mmol/L；F：果糖10 mmol/L；K：氯化鉀50 mmol/L 和L- 丙氨酸10 mmol/L），均采用分析純?cè)噭?，用?%。

顯微鏡：尼康E100 及配套照相系統(tǒng)。

1.2 鏡檢法觀察芽孢萌發(fā)情況 細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料染色部分帶正電荷，因此堿性染料很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色，經(jīng)染色后細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明對(duì)比。芽孢桿菌在休眠芽孢狀態(tài)時(shí)不帶相應(yīng)電荷無(wú)法染色，因此通過(guò)堿性染料染色后采用100 倍油鏡觀察可以很容易區(qū)分細(xì)菌的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體。本試驗(yàn)選擇草酸銨結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色。

1.3 濁度法測(cè)定芽孢萌發(fā)率 當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低，在一定范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與吸光值（OD 值）成正比，營(yíng)養(yǎng)體對(duì)光線吸收強(qiáng)于芽孢，在芽孢未萌發(fā)時(shí)，OD 值較低，隨著萌發(fā)成為營(yíng)養(yǎng)體，OD 值逐漸升高。本試驗(yàn)選擇波長(zhǎng)為600 nm 的吸光值，萌發(fā)試驗(yàn)開(kāi)始后，每間隔2 h 測(cè)定1 次OD 值，簡(jiǎn)稱OD600。取12 個(gè)500 mL廣口三角瓶，分別加入300 mL LB 培養(yǎng)基，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后將其分為4 組，每組3 個(gè)重復(fù)，A 組加入107CFU/mL N66，B 組加入108CFU/mL N66，C 組加入107CFU/mL S03，D 組加入108CFU/mL S03。將接種好的三角瓶置于32℃、100 r/min 的搖床上培養(yǎng)，取樣測(cè)定0 、2 、4 、6 、8 h 的OD600并染色鏡檢觀察芽孢萌發(fā)情況。

1.4 菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢率 一般細(xì)菌的致死點(diǎn)為溫度68℃與時(shí)間30 min 以下，75℃水浴保持20 min 可以殺死芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)體，但芽孢不受損失。分別在培養(yǎng)2、4、8 h 進(jìn)行取樣，將樣品在75℃下進(jìn)行水浴20 min，殺死營(yíng)養(yǎng)體后測(cè)定剩余芽孢含量。取6 個(gè)500 mL 的廣口三角瓶，分別加入300 mL LB 培養(yǎng)基（或葡萄糖玉米粉培養(yǎng)基），121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后將其分為2 組，每組3 個(gè)重復(fù)，A 組加入108CFU/mLS03，B 組加入108CFU/mL K91，將接種好的三角瓶置于32℃、100 r/min 的搖床上培養(yǎng)，取樣測(cè)定0 、2 、4 、6 、8 h 的芽孢剩余量。萌發(fā)率=（初始芽孢含量－萌發(fā)后芽孢含量）/初始芽孢含量×100%。

1.5 熱激活和萌發(fā)劑試驗(yàn) 將添加完菌種的三角瓶放于70℃水浴中熱激活30 min，處理后迅速置于32℃水浴中降溫。再置于32℃、100 r/min 的搖床上培養(yǎng)并測(cè)定萌發(fā)率。在LB 培養(yǎng)基中添加1%的萌發(fā)劑，熱激活后開(kāi)展萌發(fā)率測(cè)定試驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 19.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's多重比較，以P＜0.05 為差異顯著水平判定依據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 不同亞種發(fā)酵液在LB 培養(yǎng)基中萌發(fā)情況 通過(guò)結(jié)晶紫染色-油鏡（400×）觀察發(fā)現(xiàn)（圖1），枯草亞種K91 和納豆亞種N66 在LB 液體培養(yǎng)基中萌發(fā)良好，在4 h 已經(jīng)大量萌發(fā)但仍可見(jiàn)未萌發(fā)的芽孢，在8 h 可見(jiàn)大量長(zhǎng)桿和短桿，完全未萌發(fā)的芽孢基本觀察不到；而沙漠亞種S03 2 h 基本未萌發(fā)，4～8 h 萌發(fā)量增多，可見(jiàn)的桿菌很少。

圖1 不同亞種發(fā)酵液在LB 培養(yǎng)基中萌發(fā)情況（400×）

如圖2 所示，同種菌2 種接種量8 h 內(nèi)的OD600隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，N66 和S03 吸光值增幅不同。N66 2 種接種量下8 h OD600均增加0.54（表1），沙漠亞種S03 在107CFU/mL、108CFU/mL 接種量時(shí)OD600分別增加0.38、0.33，接種量低的組萌發(fā)會(huì)多一些（P＜0.05）（表1）。綜上，菌種差異帶來(lái)的萌發(fā)影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于接種量對(duì)萌發(fā)的影響。

2.2 3 個(gè)枯草亞種萌發(fā)率比較 由圖2 可知，32℃、LB培養(yǎng)基中，枯草亞種K91 和納豆亞種N66 的萌發(fā)率前4 h 有顯著性差異（P＜0.05），6～8 h 趨于一致（P＞0.05），但均顯著高于沙漠亞種S03。K91 和N66 在培養(yǎng)2 h 時(shí)萌發(fā)率已達(dá)到60% 以上，8 h 萌發(fā)率可達(dá)80% 以上，S03 即使在培養(yǎng)8 h 時(shí)萌發(fā)率也不足30%（圖2）。

圖2 枯草芽孢桿菌3 個(gè)亞種萌發(fā)率比較

2.3 熱激活對(duì)沙漠亞種S03 萌發(fā)和增殖的影響 如圖3所示，采用熱激活手段對(duì)沙漠亞種S03 進(jìn)行處理后，芽孢萌發(fā)率整體提升不明顯，8 h 萌發(fā)率低于16%。但是與不進(jìn)行熱激活相比，熱激活對(duì)增殖有促進(jìn)作用（P＜0.05），熱激活組與不進(jìn)行熱激活組8 h 后菌量分別增殖4 倍和3.6 倍，分別達(dá)到5.3×108CFU/mL 和3.9×108CFU/mL。2.4 萌發(fā)劑對(duì)沙漠亞種S03 萌發(fā)率的影響 如圖4 所示，在LB 培養(yǎng)基中添加以L-天冬酰胺和L-丙氨酸為主的萌發(fā)劑對(duì)沙漠亞種S03 的芽孢萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），2 h 芽孢萌發(fā)率由原來(lái)的低于30%提高到83.9%；8 h 萌發(fā)率為92.5%，同時(shí)總菌量增殖3 倍，而在未加萌發(fā)劑時(shí)增殖只有1.9 倍。

圖3 熱激活對(duì)沙漠亞種S03 萌發(fā)率的影響

圖 4 LB 培養(yǎng)基中添加萌發(fā)劑后沙漠亞種S03萌發(fā)率和菌量變化

在葡萄糖玉米粉培養(yǎng)基中添加相同的萌發(fā)劑沙漠亞種S03 的萌發(fā)率也顯著提升（P＜0.05），8 h 萌發(fā)率90.1%，與在LB 培養(yǎng)基中的提升作用無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。但菌的增殖情況顯著低于LB 培養(yǎng)基中（P＜0.05），添加萌發(fā)劑前后總菌量均降低（圖5）。

圖5 葡萄糖玉米粉培養(yǎng)基添加萌發(fā)劑后沙漠亞種S03萌發(fā)率和菌量的變化

表1 納豆亞種N66 和沙漠亞種S03 萌發(fā)過(guò)程中的OD 600 變化

3 討 論

在LB 培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基（NB）等常用的細(xì)菌培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)良好，溫度和溶氧適宜時(shí)，短時(shí)間內(nèi)萌發(fā)效率高、整體生長(zhǎng)周期短[6]。而枯草芽孢桿菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中使用時(shí)，因池水溫度較低、營(yíng)養(yǎng)貧瘠，其生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，為了縮短芽孢在水體中的萌發(fā)時(shí)間，在潑灑前部分使用者會(huì)進(jìn)行提前活化，為了便于操作及出于成本考慮，活化常采用1%～5%紅糖、葡萄糖、豆粕、玉米粉等作為培養(yǎng)基，將1 kg 含活菌200×108CFU/g 的產(chǎn)品加入10～100 kg 水中，水溫20～30℃，氣石曝氣2～4 h。在這種接種密度大（大于2×108CFU/mL）、營(yíng)養(yǎng)不足（培養(yǎng)基是正常用量的10%～20%）、溫度偏低的條件下，芽孢菌萌發(fā)或繁殖存在一定困難。

芽孢萌發(fā)可以通過(guò)鏡檢定性觀察桿菌與芽孢的大體比例，要準(zhǔn)確確定萌發(fā)率則需要通過(guò)水浴殺死營(yíng)養(yǎng)體后進(jìn)行平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，后者工作量較大、耗時(shí)較長(zhǎng)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，即使在營(yíng)養(yǎng)條件適中的LB 培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌3 個(gè)亞種萌發(fā)水平不一，枯草亞種K19 和納豆亞種N66 在試驗(yàn)條件下非常容易萌發(fā)，而沙漠亞種S03 萌發(fā)率較低，8 h 萌發(fā)率只有28.7%。沙漠亞種在應(yīng)用中有獨(dú)特的作用，如產(chǎn)生抗菌物質(zhì)[7]、絮凝作用（本實(shí)驗(yàn)室前期研究，尚未發(fā)表）等，因此尋找提高其萌發(fā)率的方法對(duì)其生產(chǎn)應(yīng)用有借鑒意義。

關(guān)于芽孢萌發(fā)的過(guò)程，有研究表明當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸到芽孢時(shí)，會(huì)滲透穿過(guò)芽孢衣和皮層，與孢子內(nèi)膜的受體蛋白結(jié)合，觸發(fā)芽孢的萌發(fā)，芽孢內(nèi)部迅速發(fā)生一系列變化：H+和Zn2+釋放，芽孢核內(nèi)部pH 上升，繼而Ca2+-DPA 大量釋放，被水所替代，芽孢的耐熱性下降；芽孢皮層的肽聚糖層水解，芽孢核內(nèi)部蛋白質(zhì)流動(dòng)性增強(qiáng)，酶活性加強(qiáng)，開(kāi)始合成ATP；SASP 蛋白降解，芽孢DNA 釋放，進(jìn)而引導(dǎo)RNA、蛋白質(zhì)、DNA 的合成[8]。成孢溫度、萌發(fā)劑、熱激活和萌發(fā)緩沖液等因素對(duì)芽孢的萌發(fā)都有一定影響[8-10]。本試驗(yàn)針對(duì)萌發(fā)率低的沙漠亞種S03 結(jié)合萌發(fā)機(jī)制，分別在試驗(yàn)室通用LB 培養(yǎng)基和水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)用培養(yǎng)基中增加了以L-天冬酰胺和L-丙氨酸為主要成分的萌發(fā)劑，結(jié)果表明，在2 種培養(yǎng)基中添加萌發(fā)劑后沙漠亞種S03 芽孢萌發(fā)率都顯著提高，活化8 h 后在LB 培養(yǎng)基中總菌量可增殖3 倍，而在葡萄糖玉米粉培養(yǎng)基中總菌量下降，推測(cè)后者營(yíng)養(yǎng)不足，芽孢萌發(fā)后接觸不到足夠營(yíng)養(yǎng)而造成死亡。

綜上，菌種是影響萌發(fā)難易程度的關(guān)鍵因素，劑型和接種量不是關(guān)鍵因素，以L-天冬酰胺和L-丙氨酸為主的萌發(fā)劑可顯著提高沙漠亞種的萌發(fā)效率。萌發(fā)后需給芽孢提供足夠的營(yíng)養(yǎng)才能達(dá)到有效繁殖的目的，否則會(huì)使總菌量降低。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌枯草亞種K91 和納豆亞種N66 的萌發(fā)情況顯著好于沙漠亞種S03，107～108CFU/mL接種量對(duì)萌發(fā)的影響不顯著；僅熱激活處理對(duì)萌發(fā)率影響不顯著，添加萌發(fā)劑可使沙漠亞種S03 的萌發(fā)率有顯著提高，可達(dá)到枯草芽孢桿菌枯草亞種和納豆亞種的萌發(fā)水平。