李譽琦 馬佩鈺 劉涵 王靈芝 高仁玲 李慧娟

（1. 山東科技大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，青島 266590；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488）

亞硝酸鹽是生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的成分之一，也是微生物硝化作用和反硝化作用的中間產(chǎn)物。高濃度的亞硝酸鹽對水生生物、哺乳動物及人類具有多種毒害效應(yīng)［1-2]，降低及控制亞硝酸鹽含量是水處理工藝中的重要步驟。與物理法和化學(xué)法脫氮方式相比，生物法去除亞硝酸鹽氮因具有高效、安全、成本低、無二次污染等優(yōu)點，成為最常用的技術(shù)。反硝化細(xì)菌是去除環(huán)境中對生物有毒害作用亞硝酸鹽的重要菌群，通過好氧或厭氧反硝化過程將硝酸鹽或亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成一氧化二氮或氮氣，從根本上解決水體中亞硝酸鹽污染的問題［3-4]。好氧反硝化菌主要分離自活性污泥、廢水、廢水處理系統(tǒng)、土壤、海底沉積物等環(huán)境中［5]，涵蓋的種屬類型多，有假單胞菌屬（Pseudomonas）［6]、不動桿菌屬（Acinetobacter）［7]、芽孢桿菌屬（Bacillus）［8]、腸桿菌屬（Enterobacter）［3]、海桿菌屬（Marinobacter）［9]和蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）［10]等。

反硝化細(xì)菌多在25-37℃范圍內(nèi)有較高的反硝化能力，而低溫或高溫均會影響菌株的生長和酶的活性。超過40℃，細(xì)菌的硝化和反硝化過程受到強烈抑制［3]。生產(chǎn)實際中，很多工業(yè)廢水的溫度都達(dá)到45℃以上，利用常規(guī)反硝化細(xì)菌處理，需將廢水進行冷卻處理。若直接用高溫反硝化細(xì)菌處理高溫廢水，不僅省去高溫廢水冷卻處理環(huán)節(jié)，減少設(shè)備投資，也提高了水處理效率。目前關(guān)于耐高溫反硝化細(xì)菌的報道有限，在50℃高溫條件下，反硝化細(xì)菌TAD1對初始濃度（113.58 mg/L）相同的硝酸鹽氮去除率高出亞硝酸鹽氮近4倍，對亞硝酸鹽的脫氮率不足25%，最適的反硝化氮源為硝酸鹽［11]；菌株Bacillus licheniformisJH8可使250 mg/L亞硝酸鹽的去除率達(dá)到97.63%［12]，經(jīng)溫度梯度馴化的菌株Brevibacillussp. XF-03可使NO2--N濃度由初始的100 mg/L降至4.9 mg/L，降解率達(dá)到95.1%［13]，但這兩株菌是否耐受更高濃度的亞硝酸鹽未見報道；分離自集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的菌株Bacillus megateriumS379在25-40℃范圍內(nèi)對320 mg/L亞硝酸鹽的去除率均在70%以上，而45℃條件下僅為57.93%［14]。目前，已報道的耐高溫反硝化細(xì)菌中缺少既耐高溫又耐高濃度亞硝酸鹽的細(xì)菌。因此，篩選耐高溫耐高濃度亞硝酸鹽且具有高效好氧反硝化能力的細(xì)菌對高溫廢水和煙氣脫硝具有重要的理論意義和實踐意義。

本研究從某水產(chǎn)養(yǎng)殖廠廢水中篩選到菌株Y7，發(fā)現(xiàn)該菌株對亞硝酸鹽的最大耐受濃度達(dá)到1 100 mg/L而且能耐受50℃高溫，進一步利用單因子優(yōu)化實驗，確定了菌株Y7在高溫下降解亞硝酸鹽的最適條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗中的耐高溫反硝化細(xì)菌菌株Y7，分離自某水產(chǎn)養(yǎng)殖廠的廢水。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（g/L）：（NH4）2SO41、 丁 二 酸 鈉 3.4、KNO30.5、MgSO4·7H2O 0.1、K2HPO41.5、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.5、NaNO20.5。

篩選固體培養(yǎng)基（g/L）：丁二酸鈉3.4、KNO31、MgSO4·7H2O 0.1、K2HPO41.5、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.5、1%BTB（溴百里酚藍(lán)）1 mL，瓊脂20。

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO40.5、K2HPO40.5、MgSO4·7H2O 0.2、CaCl20.1、NaCl 1、 葡 萄 糖 5、NaNO20.1。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選、分離與鑒定 將采自不同養(yǎng)殖廠的廢水水樣2 mL加入含有富集培養(yǎng)基的三角瓶中于30℃條件下170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，連續(xù)富集培養(yǎng)兩次后，取菌懸液用無菌生理鹽水進行不同梯度稀釋后在篩選平板上涂布，30℃條件下恒溫培養(yǎng)2-3 d，挑取有藍(lán)色暈圈的單菌落進行平板劃線純化，純化后的菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，離心取上清，利用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測定殘留的NO2--N 含量［15]，選擇上清液中NO2--N濃度最低的菌株為目標(biāo)菌株進行后續(xù)研究。

目標(biāo)菌株Y7在LB固體平板上劃線，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。取單菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，取菌液在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體顯微形態(tài)。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［16]進行菌株Y7的生理生化鑒定。

挑取菌株Y7單菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中30℃條件下170 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，離心收集菌體，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒（天根生化，北京）提取菌株Y7的基因組DNA，利用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 進 行 16S rRNA基因的PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，30個循環(huán)（95℃ 1 min、53℃ 1 min、72℃1.5 min），延伸72℃ 10 min。用膠回收試劑盒（天根生化，北京）純化大約1.5 kb的目的片段，將純化后的PCR產(chǎn)物送至華大基因進行測序，將所得序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行在線比對分析，利用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株Y7的種屬。

1.2.2 菌株Y7的反硝化性能研究 挑取菌株Y7單菌落接于LB液體培養(yǎng)基中，30℃條件下170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，按2%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別在12 h、24 h取樣，離心取上清液測定亞硝酸鹽（NO2--N）含量，根據(jù)下式計算亞硝酸鹽降解率。亞硝酸鹽降解率（%）=（亞硝酸鹽起始濃度-亞硝酸鹽終濃度）/亞硝酸鹽起始濃度×100%。

以對菌株生長和脫氮影響比較顯著的碳源、亞硝酸鹽濃度、初始pH、裝液量、接種量、種齡、溫度等為單因素變量，對菌株Y7的脫氮條件進行優(yōu)化，除種齡優(yōu)化外，其他因素中所轉(zhuǎn)接的種子液均為活化24 h的菌液。碳源種類是將發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖替換為如下碳源（蔗糖、可溶性淀粉、甘油、酒石酸鉀鈉、丁二酸鈉）；菌株Y7對NaNO2耐受程度設(shè)置為200、400、600、800和1 000 mg/L；用1 mol/L HCl和NaOH將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)整為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0；在250 mL三角瓶中的裝液量分別設(shè)置為30、50、70、100和150 mL；將OD600=1.5的菌液按照1、3、5、7和10%（V/V）的量轉(zhuǎn)接到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中；種齡分別設(shè)置為8、12、24和32 h；發(fā)酵溫度分別設(shè)置為25、30、37、42和50℃。研究碳源種類的亞硝酸鹽濃度為200 mg/L，研究pH、裝液量的亞硝酸鹽濃度為600 mg/L，研究接種量的亞硝酸鹽濃度為800 mg/L，研究種齡的亞硝酸鹽濃度為1 000 mg/L，研究溫度的亞硝酸鹽濃度為1 100 mg/L。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選及鑒定

經(jīng)富集培養(yǎng)、平板初篩和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)測定菌株對亞硝酸鹽降解率的復(fù)篩，最終確定一株降解NaNO2效果最好的菌株，編號為Y7。菌株Y7在LB固體培養(yǎng)基上劃線，置于30℃培養(yǎng)1 d，菌落形態(tài)的結(jié)果如圖1-A所示，菌落近圓形，中間凸起、乳白色、邊緣不規(guī)則，表面光滑有黏性。菌株Y7顯微形態(tài)的結(jié)果如圖1-B所示，細(xì)胞呈細(xì)長桿狀。菌株Y7的生理生化鑒定實驗結(jié)果表明：接觸酶、脲酶、蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶為陽性；而脂酶、MR實驗、VP實驗均為陰性。

圖1 菌株Y7的菌落形態(tài)（A）和顯微形態(tài)（B）

以菌株Y7的基因組DNA為模板，以16S rRNA基因的通用引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后獲得1 450 bp的堿基序列，將該序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST同源序列比對，菌株Y7與Bacillus相似性高達(dá)99%，利用MEGA 5.0構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖2所示，菌株Y7與Bacillus subtilis菌株聚類在一起，故將菌株Y7命名為Bacillus subtilisY7。

2.2 不同因素對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響

2.2.1 菌株Y7的生長曲線 挑取菌株Y7單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃條件下170 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔一定時間取菌液在600 nm下測定OD值，間接反映菌體的生長狀況。菌株Y7的生長曲線如圖3所示，從接種開始到第12小時，菌株Y7的生長處于延滯期，生長緩慢，600 nm下的OD值為0.456，延滯期較長，可能與接種的是單菌落有關(guān)；第12-24小時期間為菌株Y7的指數(shù)生長期，24 h后菌體濃度達(dá)到最高，OD600達(dá)到1.757；第24-28小時為菌株Y7的生長穩(wěn)定期，OD600略有增加；第28小時以后細(xì)菌進入衰亡期。因此，指標(biāo)的測定時間選擇發(fā)酵培養(yǎng)第12和第24小時兩個時間點。

圖2 菌株Y7基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

圖3 菌株Y7的生長曲線

2.2.2 碳源種類對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響 在碳源種類的實驗中，亞硝酸鈉的初始濃度為200 mg/L。實驗結(jié)果如圖4所示，不加碳源時，菌株Y7對亞硝酸鹽的降解率不足10%。菌株Y7發(fā)酵培養(yǎng)12 h時，碳源為丁二酸鈉的降解亞硝酸鈉效率最高，達(dá)到59.3%；其次為酒石酸鉀鈉（55.1%），甘油僅為35.9%；然而，發(fā)酵培養(yǎng)24 h時，甘油為碳源時，菌株Y7對亞硝酸鈉的降解率高達(dá)84.9%，顯著高于其他碳源。菌株Y7在葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉等糖類碳源中發(fā)酵培養(yǎng)后對亞硝酸鈉降解率最高不超過50%。因此，最適碳源為甘油。

圖4 碳源種類對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響

2.2.3 菌株Y7對亞硝酸鹽的耐受性 不同菌株對亞硝酸鹽的耐受性差別很大。菌株Y7對亞硝酸鹽濃度的耐受性如圖5所示，以甘油為碳源，起始亞硝酸鈉濃度為200和400 mg/L時，菌株Y7發(fā)酵培養(yǎng)僅12 h時，其對亞硝酸鈉的降解率就達(dá)到100%；隨著亞硝酸鈉濃度的逐漸增加，菌株Y7對亞硝酸鹽的降解能力顯著下降，600-1 000 mg/L時，降解率僅為22.2%-33.7%，因此，在下一步的優(yōu)化過程中，起始亞硝酸鹽濃度定為600 mg/L。

2.2.4 起始pH、裝液量、接種量和種齡對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響 在亞硝酸鈉為600 mg/L時，起始pH對菌株Y7降解亞硝酸鹽的結(jié)果如圖6-A所示，菌株Y7發(fā)酵培養(yǎng)12 h時，在pH 5-9范圍內(nèi)的降解效率在17.3%-23.6%；發(fā)酵培養(yǎng)24 h時，在pH 5-9范圍內(nèi)的降解效率在29.0%-37.2%；最高值與最低值相差不超過10%?？梢?，菌株Y7在較寬pH范圍內(nèi)均能有效降解亞硝酸鹽。為了方便實驗，選取pH 7.0為菌株Y7的最適起始pH。裝液量間接反映溶氧量對菌株降解亞硝酸鹽的影響，圖6-B的結(jié)果表明：在250 mL三角瓶中裝液量為30-70 mL時，發(fā)酵培養(yǎng)12 h和24 h的降解率在20.0%-29.6%之間，而裝液量100和150 mL時，降解率明顯上升，發(fā)酵培養(yǎng)24 h時，降解率接近100%。因此，確定在250 mL三角瓶中的裝液量為100 mL。研究接種量對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響時，亞硝酸鈉濃度設(shè)置為800 mg/L，種子液OD600為1.5，結(jié)果如圖6-C所示，1%-5%接種量時，降解率在20%左右；接種量7%時，降解率提高了近4倍；接種量為10%時，降解率接近100%。因此，接種量確定為10%。研究種齡對菌株Y7降解亞硝酸鹽影響時，亞硝酸鈉濃度設(shè)置為1 000 mg/L，將活化8、12、24和32 h的種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖6-D所示，種齡8、12和32 h的種子液按照10%接種量轉(zhuǎn)接到含100 mL以甘油為碳源發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng)12 h和24 h時，對亞硝酸鈉的降解率差距不大，均在20%左右；而種齡24 h的種子液轉(zhuǎn)接到以甘油為碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)12 h時，降解率僅為35.9%；而發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的降解率高達(dá)81.3%。因此，最適種齡為24 h。

圖5 菌株Y7對亞硝酸鹽的耐受性

圖6 起始pH、裝液量、接種量、種齡對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響

2.2.5 溫度對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響 在溫度對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響中，所采用的亞硝酸鈉濃度為1 100 mg/L，實驗結(jié)果如圖7所示，菌株Y7在25、30、37、42和50℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，降解率分別為81.5%、99.7%、84.3%、99.7%和85.3%，降解率均較高；發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，菌株Y7在不同溫度下對亞硝酸鹽的降解率均接近100%。表明菌株Y7對溫度有較寬的適應(yīng)范圍，且高溫不影響菌株對亞硝酸鈉的降解能力。

圖7 溫度對菌株Y7降解亞硝酸鹽的影響

3 討論

反硝化細(xì)菌去除亞硝酸鹽受到多種因素的影響。在好氧條件下，碳源不僅作為菌體生長的營養(yǎng)源，也是反硝化過程的能量來源和電子受體，對細(xì)菌的生長和反硝化效率具有重要作用［6]。在無碳源的情況下，菌株的反硝化能力極低［12，17]。反硝化細(xì)菌的碳源種類包括糖類、檸檬酸鹽、乙酸鹽、丁二酸鹽、甘油、醇類等。糖類是最易被異養(yǎng)微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)與能源物質(zhì)，其中葡萄糖作為單糖更易被反硝化細(xì)菌吸收利用，如菌株Enterobacter cloacaeHNR［3]和Providencia rettgeriYL［17]反硝化過程中的最適碳源為葡萄糖。然而，菌株P(guān)sychrobactersp.S1-1以葡萄糖為碳源時，不利于其生長和反硝化［18]。檸檬酸鹽和丁二酸鈉作為三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，能直接被細(xì)菌所利用，廣泛被用作細(xì)菌好氧反硝化的碳源［9，11-12，18-20]。此外，細(xì)菌好氧反硝化的最適碳源還有乙酸鈉［21]和乙醇［22]等。在本研究中，菌株Y7以葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉為碳源時，其反硝化效率明顯低于甘油，甘油作為一種化工產(chǎn)品，相比其他碳源，成本更低。甘油作為最適碳源也有相類似的報道，菌株P(guān)seudomonas alcaligenesHP1以檸檬酸鈉和甘油為最適碳源［23]。因此，不同反硝化細(xì)菌所利用的碳源種類是不同的，具有明顯的種屬特異性［9]。

亞硝酸鹽中氮的去除主要通過微生物的同化作用、酶降解和酸降解實現(xiàn)，其中酶降解亞硝酸鹽的途徑是最主要方式［4]。培養(yǎng)基中的pH不僅影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且影響酶的活力。此外，微生物的脫氮系統(tǒng)對pH的變化很敏感。不同微生物對pH適應(yīng)范圍不同，文獻已報道的耐高溫、低溫或嗜溫反硝化菌，其最適 pH 多在 7-9［5，8-9，11，20-21]，菌株Bacillus megateriumS379在pH＜6，反硝化能力幾乎喪失［14]。中性偏堿環(huán)境利于好氧菌的反硝化，而偏酸環(huán)境利于厭氧菌的反硝化過程［10]。菌株Y7在pH 5-9范圍內(nèi)，對亞硝酸鹽氮的去除率差異不大（圖6-A），與所報道的Ochrobactrum anthropicLJ81菌株相一致［10]。因菌株Y7的pH適應(yīng)范圍更廣，故對偏酸性或偏堿性的廢水均有較好的處理效果。

溫度是影響微生物脫氮的關(guān)鍵因素之一。目前，已報道的好氧反硝化菌的最適溫度一般為 25-37℃，低于10℃或高于40℃時，反硝化作用受到強烈抑制［4-5]。對于低溫和高溫好氧反硝化細(xì)菌的報道均較少，何騰霞等［20，24]從長期淹水的冬水田中分離了多株耐冷反硝化細(xì)菌，在15℃條件下對亞硝酸鹽的去除率仍然較高。趙驚鴻等［12]從燃煤電廠生物滴濾系統(tǒng)中分離到一株地衣芽孢桿菌JH8，該菌能在50℃的高溫條件下24 h內(nèi)將初始濃度為1 000 mg/L KNO3和250 mg/L NaNO2去除。耐高溫好氧反硝化細(xì)菌（Chelatococcussp. TAD1）在50℃高溫條件下24 h內(nèi)將培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽氮由初始的113.58 mg/L 降低到 85.31 mg/L，脫氮率僅為 24.89%［11]。分離自水產(chǎn)養(yǎng)殖池廢水中的菌株Bacillus megateriumS379在25-40℃范圍內(nèi)對初始濃度為250 mg/L NaNO2的脫氮率在86.26%-97.96%［14]。與上述的高溫好氧反硝化細(xì)菌相比，菌株Y7在25-50℃范圍內(nèi)，24 h內(nèi)均能將初始濃度1 100 mg/L的NaNO2全部降解，菌株Y7在耐受高溫和耐受高濃度亞硝酸鹽方面比上述菌株具有明顯的優(yōu)勢。但溫度為20℃，反硝化能力極低（結(jié)果未顯示），菌株Y7不適于低溫環(huán)境下的水處理。水產(chǎn)養(yǎng)殖廠水溫在1 d之中波動較大，溫度適應(yīng)范圍寬的好氧反硝化細(xì)菌更適于此類水質(zhì)的處理。這些特性使得菌株Y7在工業(yè)廢水、養(yǎng)殖廢水處理及燃煤電廠煙氣中的脫硝過程中，有著廣泛的應(yīng)用前景。

亞硝酸鹽不僅對水生動物、哺乳動物等具有致癌、致畸、影響血紅蛋白運輸氧等較強的毒害作用［1-2]；對微生物也有一定的毒害作用，并影響其降解亞硝酸鹽的能力。已報道的關(guān)于微生物對亞硝酸鈉耐受濃度一般在 100-200 mg/L［8，20]，菌株Bacillus megateriumS379在560 mg/L亞硝酸鹽條件下生長受到嚴(yán)重的抑制［14]。而本研究中的菌株Y7最高可耐受1 100 mg/L亞硝酸鈉，當(dāng)濃度達(dá)到1 200 mg/L時，菌株Y7的生長被完全抑制，其降解亞硝酸鹽的能力喪失，對菌體產(chǎn)生較大的毒害作用。與已報道的以亞硝酸鹽為氮源的反硝化細(xì)菌相比，菌株Y7耐受濃度更高，其作用機理及所涉及的酶值得進一步深入的研究和探討。

4 結(jié)論

本研究從某水產(chǎn)養(yǎng)殖廠廢水中篩選到菌株Y7，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特征分析及16S rRNA基因的序列分析，該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。該菌可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶，能一定程度上降解養(yǎng)殖水體中多余飼料或水產(chǎn)生物的排泄物。進一步研究發(fā)現(xiàn)菌株Y7在pH 5-9范圍內(nèi)，對亞硝酸鹽的去除率差別不大，有較寬的pH適應(yīng)范圍；而該菌株在25-50℃范圍內(nèi)，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，對1 100 mg/L亞硝酸鈉的降解效率均接近100%，有較寬的溫度適應(yīng)范圍；而菌株Y7對亞硝酸鈉的耐受性高達(dá)1 100 mg/L。