毛然然 李小艷 武瑤 張麗珊 林鎮(zhèn)平 林向民

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室，福州 350002）

嗜水氣單胞菌為氣單胞菌屬的一種革蘭氏陰性短桿菌，常導(dǎo)致淡水魚類患運動性氣單胞菌敗血癥，該疾病每年都給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成數(shù)百萬美元的經(jīng)濟損失［1-3]，而疫苗是防控水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)感染性疾病最有效的策略之一［4]。目前的漁用疫苗主要包括滅活疫苗、減毒疫苗、核酸疫苗和亞單位疫苗等，其中亞單位疫苗是一種只保留病原體中有效的免疫原成分（外膜蛋白、糖蛋白、分泌蛋白、外毒素、胞外蛋白酶等）而不含有其他無關(guān)或者有害成分的新型疫苗，因具有組分清楚、安全性好、技術(shù)成熟、便于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點被廣泛推廣。外膜蛋白（OMP）是存在于細(xì)菌外膜中所有蛋白的總稱，在維持外膜結(jié)構(gòu)、保證物質(zhì)運輸?shù)确矫嬗兄匾饔茫?]。已有多項研究表明，細(xì)菌的主要外膜蛋白具有很強的免疫原性，是重要的保護性抗原，且利用致病菌的OMP做免疫原還可使魚產(chǎn)生對不同血清型菌株感染的交叉保護力［6]，因此通過制備外膜蛋白亞單位疫苗預(yù)防嗜水氣單胞菌的感染是當(dāng)今疫苗研究的主要方向之一。但是目前對嗜水氣單胞菌外膜蛋白免疫原性研究多集中于實驗室篩選階段，需要對不同外膜蛋白免疫效果進行全面分析，篩選出高效且適用于規(guī)?；a(chǎn)的疫苗。本文基于以上現(xiàn)狀選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白OprM為研究對象，探究OprM蛋白作為亞單位疫苗在模式生物斑馬魚體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)與嗜水氣單胞菌強毒株攻毒后的相對免疫保護率，為魚類養(yǎng)殖業(yè)疫苗研究提供理論依據(jù)與實踐參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株、質(zhì)粒與斑馬魚 本實驗所需的原核表達載體pET-32a（+）、嗜水氣單胞菌 ATCC 7966和嗜水氣單胞菌強毒株LP-2為本實驗室保存；健康斑馬魚 200條（0.3±0.1 g）購于福州花鳥市場，實驗前飼養(yǎng)一周，每天喂食1次，換水1次，24 h供氧。

1.1.2 試劑和引物 LB培養(yǎng)基：20 g 胰蛋白酶胨，20 g NaCl、10 g 酵母粉溶于2 000 mL ddH2O；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶購買自Thermo公司；大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購買于全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自 Omega公司；氨芐青霉素（AMP）購自生工生物工程有限公司；引物由福州博尚生物公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 以嗜水氣單胞菌ATCC 7966總基因組為模板，用oprM基因引物進行PCR擴增。所得產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測所得特異性片段用膠回收試劑盒進行回收，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 基因克隆引物序列

1.2.2 表達質(zhì)粒構(gòu)建 用質(zhì)粒提取試劑盒 pET-32a質(zhì)粒，對克隆的目的片段和提取的 pET-32a 質(zhì)粒分別用Hind III 和EcoR I 進行雙酶切。酶切后進行連接得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在 LB（含100 μg/mL AMP）平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.3 重組菌株的表達和純化 挑取單克隆至 5 mL LB培養(yǎng)基（含 100 μg/mL AMP），37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜。然后轉(zhuǎn)移至 200 mL 新鮮 LB 培養(yǎng)液（含100 μg/mL AMP）中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.3-0.6，加入 1 mmol/L IPTG 于 16℃誘導(dǎo)菌株10-12 h。然后在 4℃、10 000 r/min下離心，棄上清，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，將菌體重懸于5 mmol/L 咪唑溶液中，進行超聲破碎處理。離心收集沉淀，所得沉淀溶解于 8 mol/L Urea 緩沖液中，通過 Ni-NTA 樹脂柱進行純化（過程中使用6 mol/L，4 mol/L，2 mol/L Urea緩沖液梯度復(fù)性）。SDS-PAGE檢測所純化條帶，并將獲得的蛋白存放于-20℃。

1.2.4 腹腔注射斑馬魚 將實驗組OprM 蛋白與對照組BSA分別與弗氏佐劑以 1∶1 的比例均勻混合，充分乳化。接著對斑馬魚進行腹腔注射，每尾免疫3 μg。免疫14 d后，對各組進行再次加強免疫，注射量與第一次相同，持續(xù)到28 d。

1.2.5 蛋白免疫后斑馬魚免疫反應(yīng)檢測 利用Trizon法分別提取實驗組、對照組斑馬魚內(nèi)臟RNA：將斑馬魚內(nèi)臟取出后，加入液氮并置于研缽中研碎，然后向各樣本中加入1 mL的Trizon，靜置5 min；接著加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩，靜置2-3 min，2-8℃、12 000 r/min下離心15 min；然后吸取上層水相并加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min，2-8℃、12 000 r/min下離心10 min，去上清；最后加入1 mL75%乙醇，振蕩混勻，2-8℃、7 500 r/min下離心5 min，去上清，干燥沉淀，測濃度后于-20℃保存。并利用qPCR技

表2 PCR定量免疫相關(guān)基因表達的引物

1.2.6 斑馬魚攻毒 取保存于-80℃ 的嗜水氣單胞菌LP-2于37℃，200 r/min下活化16-18 h，再轉(zhuǎn)接至 5 mL 試管中，37℃，200 r/min 搖至 OD=1.0，1×PBS稀釋菌液至 1×105CFU/mL，（25倍斑馬魚半數(shù)致死量）。將魚用1.2.4的方法處理后，每尾注射20 μL進行攻毒實驗，每組魚為30尾，3次重復(fù)。最后每天記錄攻毒結(jié)果，連續(xù)記錄兩周，繪制相對存活率曲線。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌oprM基因的擴增

以嗜水氣單胞菌 ATCC 7966 的基因組 DNA 為模版，根據(jù)oprM基因特異性引物進行 PCR 擴增，獲得大小 1 416 bp片段，與預(yù)期oprM基因大小相符合（圖1-A）。用質(zhì)粒提取試劑盒提取 pET-32a 載體質(zhì)粒，其大小約為 5 900 bp，核酸電泳結(jié)果與預(yù)期相一致（圖1-B）。

2.2 重組菌雙酶切驗證結(jié)果

將克隆的目的片段和載體 pET-32a 用EcoR I和HindIII 進行雙酶切后，回收目的片段，將目的片段與載體連接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21 獲得重組高表達菌株。所得菌株提取質(zhì)粒后用EcoRI 和Hind III 進行雙酶切驗證，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)兩條分別位于 1 500 bp 和 5 000 bp 左右的清晰條帶，電泳結(jié)果驗證說明該重組菌成功，含有目的基因oprM。術(shù)對其進行免疫相關(guān)基因表達情況鑒定，相關(guān)基因引物如表2。

圖1 oprM 基因PCR擴增結(jié)果（A）與pET-32a質(zhì)粒檢測結(jié)果（B）

圖2 高表達重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達及其純化

所得高表達重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達和Ni-NTA樹脂柱純化后，樣品跑SDS-PAGE分析。如圖3所示，條帶1為IPTG誘導(dǎo)后重組菌全菌表達情況，可以發(fā)現(xiàn)存在明顯高表達條帶。條帶2中為經(jīng)Ni-NTA樹脂柱純化后獲得的純化蛋白，條帶單一，與目的蛋白位置一致，表明蛋白純化成功。

2.4 重組蛋白免疫相關(guān)基因表達

免疫斑馬魚28 d后，利用Trizon法提取內(nèi)臟RNA，用qPCR技術(shù)檢測7種免疫相關(guān)基因（Lyz，MHCI，MHCII，IL-1β，IL-8，IL-10和IL-15） 的mRNA表達情況［7]。注射OprM蛋白組與BSA對照組相比，大多數(shù)免疫相關(guān)基因都上調(diào)（變化倍數(shù)＞2），其中MHCI和IL-10的表達量升高的情況最為顯著，MHCI的表達量提高216.6倍，IL-10表達量提高了70.1倍。IL-1β，IL-8和IL-15表達量也有顯著的增大（圖4）。

圖3 重組菌表達與純化SDS-PAGE結(jié)果

圖4 斑馬魚的免疫相關(guān)基因表達結(jié)果

2.5 攻毒試驗結(jié)果

分別用3 μg OprM蛋白與BSA免疫斑馬魚，28 d后再用嗜水氣單胞菌強毒株LP-2攻毒后繼續(xù)觀察2周，如圖5所示，注射BSA的斑馬魚在攻毒后3天內(nèi)陸續(xù)死亡，而注射OprM蛋白后相對免疫保護率達到89.47%（相對免疫保護率=［（對照組死亡率-免疫組死亡率）/對照組死亡率]×100%）［8]。該結(jié)果表明，OprM 蛋白具有高效的免疫保護作用［9]。

3 討論

圖5 攻毒后注射免疫下接種的斑馬魚的累積存活率

嗜水氣單胞菌是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類爆發(fā)性傳染病的主要病原［10]，它還可以感染人和動物［11]，能引發(fā)人類的中耳炎、敗血癥及創(chuàng)傷面感染、腹膜炎以及急性腸胃炎等疾病［12-13]。以往防治這類危害的直接方法就是投放抗生素，但是傳統(tǒng)的抗生素防治手段因易造成耐藥性和藥物殘留等問題已在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中限制使用［14]。在如此嚴(yán)峻環(huán)境面前，一種新型治療方法的開發(fā)已迫在眉睫。疫苗作為一種無毒害，且高效便捷的治療方式，是對抗嗜水氣單胞菌的可持續(xù)替代品，深受人們的青睞。針對水生生物的疫苗主要有傳統(tǒng)疫苗、基因工程疫苗和亞單位疫苗等。其中亞單位疫苗因具有安全性高、治療效果好且成本低等優(yōu)點而成為當(dāng)今的研究熱點。細(xì)菌外膜蛋白具有較好的免疫原性，是一種潛在的疫苗候選蛋白，其中嗜水氣單胞菌外膜蛋白疫苗研究已有多篇文獻報道，例如 Maiti等［15]評估了兩種重要的嗜水氣單胞菌外膜蛋白Aha1和OmpW的免疫原性，通過將這些蛋白在大腸桿菌中過表達，純化并接種于鯉魚，結(jié)果顯示抗體水平顯著提升，分別獲得52%和71%的相對免疫保護率；Hossam等［16]研究表明，用OmpA1、Tdr和TbpA三種重組外膜蛋白免疫鯰魚，發(fā)現(xiàn)鯰魚可以很好地抵抗嗜水氣單胞菌感染，是一類較好的潛在疫苗。盡管如此，針對嗜水氣單胞菌的疫苗還未得到商業(yè)化應(yīng)用，還是有較多的外膜蛋白作為疫苗的免疫保護功能未被報道，因此尋求更全面、適用于商業(yè)化的疫苗成為現(xiàn)在抑制該菌危害的關(guān)鍵。本文以嗜水氣單胞菌的外膜蛋白OprM為研究對象，選取 pET-32a 作為連接載體，與oprM基因進行重組表達，獲得純化蛋白OprM，并將其腹腔注射斑馬魚檢測其免疫保護效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，該蛋白能夠顯著提升斑馬魚體內(nèi)免疫相關(guān)基因的應(yīng)答，且免疫保護率達到89.47%。這可能是因為OprM蛋白作為一種嗜水氣單胞菌主要的外膜蛋白，在對宿主的感染和免疫中扮演著重要的角色，是重要的保護性抗原［17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，OprM等外膜蛋白還可以激發(fā)機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答，刺激機體產(chǎn)生針對黏附素的特異性抗體，抑制細(xì)菌在體內(nèi)的定植，進而減少機體發(fā)生病變的機會［19]。以上結(jié)果表明OprM蛋白是一種可以較好地抵御嗜水氣單胞菌病害的疫苗候選蛋白。

4 結(jié)論

本研究成功克隆表達了嗜水氣單胞菌外膜蛋白 OprM，通過IPTG誘導(dǎo)表達后經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)能夠較好的純化出單一且濃度較高的OprM蛋白。將純化所得蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1等體積充分乳化制備成亞單位疫苗后，腹腔注射斑馬魚，分別觀察其免疫應(yīng)答反應(yīng)與相對免疫保護率。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內(nèi)免疫相關(guān)基因表達顯著提升，揭示該疫苗可以引起斑馬魚免疫應(yīng)答。此外攻毒實驗觀察兩周后發(fā)現(xiàn)，實驗組斑馬魚相對免疫保護率達89.47%，具有較強的免疫保護作用，是一種較佳的嗜水氣單胞菌亞單位疫苗。