高云山 劉丹丹 徐俊林 桑雨濃 梁夏夏 劉建欣 王文彬

（1. 江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，連云港 222005；2. 江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005）

氣單胞菌屬（Aeromonasspp.）是一類(lèi)嗜溫性、運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陰性菌［1-2]。氣單胞菌是導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)出血性敗血癥的主要病原，魚(yú)類(lèi)患病的主要癥狀為身體充血，腹部充氣。魚(yú)類(lèi)出血性敗血癥主要流行于淡水魚(yú)中，海洋魚(yú)類(lèi)中偶有發(fā)生，具有流行廣、發(fā)病快、傳染性強(qiáng)及死亡率高的特點(diǎn)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3-6]。同時(shí)，氣單胞菌也是一種人類(lèi)條件致病菌，通過(guò)水環(huán)境、交叉污染的食物、傷口等使人感染，典型癥狀為腹瀉、軟組織感染等［7-10]。近年來(lái)的研究表明，除了傳統(tǒng)的嗜水氣單胞菌，維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、斑點(diǎn)氣單胞菌、溫和氣單胞菌也會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)［11-12]和人類(lèi)感染［13-14]。水產(chǎn)病害的快速檢測(cè)和預(yù)警對(duì)病害的防治、水產(chǎn)品安全保障具有重要作用，國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)病原菌耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)需要。病原菌快速檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和免疫檢測(cè)方法等，但目前并沒(méi)有準(zhǔn)確性好的氣單胞菌屬快速檢測(cè)手段。氣單胞菌種類(lèi)較多，且存在多種血清型，是實(shí)現(xiàn)氣單胞菌快速檢測(cè)的主要難題之一。因此研究氣單胞菌共同表面抗原，制備氣單胞菌交叉型抗體，建立氣單胞菌屬的免疫快速診斷方法用于魚(yú)類(lèi)出血病的初步篩選將具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

外膜蛋白（Outer membrane protein，Omp）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的主要結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌的物質(zhì)運(yùn)輸、形態(tài)維持和有關(guān)物質(zhì)合成方面起著重要作用［15]。研究表明，氣單胞菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，可激發(fā)機(jī)體的體液免疫，且具有較好的保守性，是一種潛在的共同保護(hù)性抗原［16-18]。在眾多的外膜蛋白中，OmpF和OmpC是兩種細(xì)菌中最常見(jiàn)的孔蛋白，占細(xì)胞總蛋白的2%。OmpF由16條反向平行的β-鏈組成，形成嵌入膜中的桶狀結(jié)構(gòu)，并在N末端細(xì)胞外顯示8個(gè)表面抗原［19]。OmpF是氣單胞菌重要的黏附因子，屬內(nèi)相似性較高，是氣單胞菌屬保守性表面抗原，具有較高的研究?jī)r(jià)值。Secundino等［20]的研究表明，傷寒沙門(mén)氏菌的OmpF可以誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)的、終生的和特異性的抑菌抗體反應(yīng)。

目前國(guó)內(nèi)外已有研究均為嗜水氣單胞菌OmpF魚(yú)類(lèi)亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)，未見(jiàn)氣單胞菌OmpF重組蛋白用于制備氣單胞菌交叉型抗體的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)工具分析氣單胞菌OmpF的基本結(jié)構(gòu)和屬內(nèi)外同源性，并采用大腸桿菌重組表達(dá)嗜水氣單胞菌OmpF重組蛋白，評(píng)價(jià)其免疫BALB/ c小鼠后血清與氣單胞菌及其他細(xì)菌的交叉反應(yīng)，旨為進(jìn)一步制備氣單胞菌屬檢測(cè)抗體提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用的菌株見(jiàn)表1。原核表達(dá)載體pET-28a（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存。6-8周齡的BALB / c小鼠購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院。

表1 本研究所用菌株

1.1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒抽提試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ、DNA Marker、雙色預(yù)染蛋白Marker、卡那霉素、IPTG、SDS-PAGE凝膠電泳所需試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；弗氏完全和不完全佐劑、牛血清蛋白BSA購(gòu)自Sigma公司；羊抗鼠二抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；96孔酶標(biāo)板購(gòu)自無(wú)錫國(guó)盛生物工程有限公司；酶標(biāo)儀為T(mén)hermo Fisher，Multiskan FC；氣單胞菌OmpF蛋白單抗1B1為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌OmpF蛋白結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析 采用NCBI的Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）及生物信息學(xué)DNA star軟件（version：7.1.0（44））對(duì)嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpF的保守區(qū)域結(jié)構(gòu)、屬內(nèi)同源性以及蛋白序列的抗原性、暴露性進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模采用Swiss model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行，將NCBI檢索到的嗜水氣單胞菌OmpF蛋白序列粘貼到輸入框，檢索后根據(jù)全局模型質(zhì)量評(píng)估（GMQE）選擇評(píng)分最高的模板進(jìn)行建模，并與NCBI檢索的保守區(qū)域結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比。嗜水氣單胞菌OmpF與氣單胞菌孔蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用NCBI結(jié)合Mega 6（version：6.0.6）進(jìn)行，首先通過(guò)Blast檢索到與嗜水氣單胞菌OmpF（Locus CCO02501）同源性較高的氣單胞菌外膜蛋白，選取并下載14個(gè)不同種氣單胞菌的外膜蛋白的蛋白質(zhì)序列，用Mega 6打開(kāi)后采用ClustalW 進(jìn)行比對(duì)，隨后采用鄰接法（Neighbor joining，NJ）進(jìn)行建樹(shù)，自舉法（bootstrapping）的值設(shè)為1000。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 由上海生工生物有限公司合成含有GenBank上發(fā)表的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）OmpF基因序列（LOCUS：HF545837）轉(zhuǎn)入帶有BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒pET-28a（+），命名為 pET-28a（+）-OmpF。重組質(zhì)粒 pET-28a（+）-OmpF用BamHⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21（DE3）感受態(tài)中，作為工程菌株。

1.2.3 重組蛋白OmpF的表達(dá)與優(yōu)化 挑取陽(yáng)性克隆于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日按1%接種量接種于50 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，28℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。同時(shí)設(shè)置未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的陽(yáng)性克隆作為對(duì)照。離心取菌體，菌體用2.5 mL無(wú)菌水重懸，冰浴超聲破碎，離心后收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。重組表達(dá)過(guò)程中蛋白的快速和不正確折疊容易形成包涵體，較低的誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白的正確折疊有利，從而可以減少包涵體的形成［21]。因此，本研究對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)的優(yōu)化。IPTG濃度優(yōu)化：固定誘導(dǎo)溫度為25℃，誘導(dǎo)時(shí)間12 h，IPTG濃度為 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.0 mmol/L；誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：固定IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h，誘導(dǎo)溫度4、16、25、28、31、34和37℃；誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化：固定誘導(dǎo)溫度為28℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h，確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.4 OmpF包涵體的初步純化與Western blot鑒定 采用最佳誘導(dǎo)條件，即誘導(dǎo)溫度28℃，IPTG濃度0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間12 h，誘導(dǎo)表達(dá)OmpF蛋白。菌體經(jīng)離心后冰浴超聲破碎，離心收集沉淀，加入到3 mL預(yù)冷的洗滌液（20 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0、0.5 mol/L Nacl、2 mol/L 尿素、2% Triton-100、1 mmol/L EDTA），攪拌20 min，4℃，12 000 r/min，離心 10 min，棄上清，取沉淀。重復(fù)一次，洗滌4 h，去除膜碎片和膜蛋白，所得沉淀用50 mmol/L Tris-HCl洗一次，去除殘留的EDTA，再次離心棄去上清，所得的沉淀即為初步純化后的包涵體。

采用Western blot對(duì)制備的OmpF包涵體蛋白進(jìn)行鑒定。將純化后的OmpF包涵體蛋白經(jīng)10% SDSPAGE分離膠分離后，半干法轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的PBST于4℃封閉過(guò)夜；加入本實(shí)驗(yàn)室制得的識(shí)別氣單胞菌屬OmpF保守性多肽的單克隆抗體1B1（用含0.05% Tween 20 和1% BSA的PBS按1∶2 000稀釋?zhuān)?，于室溫振蕩反?yīng)1 h；用PBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（用含0.05% Tween 20 和1% BSA的PBS按1∶2 000稀釋?zhuān)谑覝卣袷幏磻?yīng)1 h；用PBST洗滌5次，每次5 min，加入沉淀型底物緩沖液，出現(xiàn)明顯條帶時(shí)，水洗終止反應(yīng)。

1.2.5 重組OmpF蛋白免疫動(dòng)物 將初步純化后的OmpF包涵體蛋白與等體積弗氏佐劑乳化后免疫BALB / c小鼠，首次免疫用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑。小鼠首免、二免免疫劑量為80 μg/只，之后的免疫劑量減半。每3周免疫一次，免疫方式為背部皮下多點(diǎn)注射。第3、4次免疫后一周尾部采血并分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 間接ELISA法和Western blot法測(cè)定血清效價(jià)及交叉反應(yīng) 氣單胞菌屬細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯在28℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，煮沸滅活，-20℃保存?zhèn)溆?。用碳酸鹽緩沖液（pH 9. 6）將滅活的菌體稀釋為 108CFU/mL，加入96孔板，于37℃包被2 h；加入含0.2%明膠的碳酸鹽緩沖液37℃封閉2 h后；加入經(jīng)抗體稀釋液（PBS，0.1% 明膠，0. 05% Tween-20）稀釋的免疫小鼠血清（從1 000倍開(kāi)始，進(jìn)行3倍梯度稀釋?zhuān)?7℃孵育30 min；PBST（0. 05% Tween-20）洗板3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（抗體稀釋液稀釋3 000倍），37℃孵育30 min；PBST洗板4次，TMB顯色15 min；2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后測(cè)定OD450吸光值。同時(shí)設(shè)置空白陰性對(duì)照，當(dāng)最高稀釋度的陽(yáng)性血清OD450值與空白陰性對(duì)照OD450值之比（P/N）≥2.1，該稀釋度即為血清效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌OmpF蛋白結(jié)構(gòu)、序列保守性及抗原性分析

經(jīng)過(guò)Swiss model同源建模和Blast發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌OmpF屬于革蘭氏陰性孔蛋白家族和Proin_4家族，分子量為36.35 kD，與大腸桿菌OmpF（cdd00342）結(jié)構(gòu)相似，即為3個(gè)相同亞基組成的孔蛋白，每個(gè)亞基各含一個(gè)位于跨膜區(qū)域的α螺旋（圖1-A）。嗜水氣單胞菌OmpF蛋白粒徑在6-10 nm，蛋白孔狀結(jié)構(gòu)為分子量低于500的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如糖類(lèi)、鹽類(lèi)的擴(kuò)散和運(yùn)輸中起到重要作用。根據(jù)外膜孔蛋白插入磷脂雙分子層的特點(diǎn)，OmpF蛋白部分暴露在細(xì)菌細(xì)胞膜外。因此，細(xì)菌表面存在部分OmpF抗原表位能被OmpF蛋白的抗體識(shí)別。通過(guò)建立嗜水氣單胞菌OmpF系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)表明（圖1-B），嗜水氣單胞菌OmpF與維氏氣單胞菌、肇東氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、臺(tái)灣氣單胞菌、湖氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、Aeromonas rivipollensis、鰻魚(yú)氣單胞菌等孔蛋白的氨基酸變異度小于25%，說(shuō)明氣單胞菌OmpF蛋白屬內(nèi)相似度較高，具有較好的氣單胞菌特異性。圖1-B中節(jié)點(diǎn)處的值為自展值，代表系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可信度。

圖1 嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpF的結(jié)構(gòu)（A）與蛋白進(jìn)化樹(shù)（B）

采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast功能在線(xiàn)對(duì)嗜水氣單胞菌OmpF與氣單胞菌屬內(nèi)菌株的序列同源性進(jìn)行了具體分析。如圖2所示，黃色部分標(biāo)出了同源性在85%以上的蛋白氨基酸序列，由圖中可以看出在N端開(kāi)始的1-40AA、70-90AA、130-160AA、170-200AA、260-280AA、300-320AA、340-360AA及C端370-380AA均有部分連續(xù)的保守序列。嗜水氣單胞菌OmpF與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的比對(duì)表明序列相似性在30%以下。這些信息說(shuō)明采用OmpF蛋白或保守性多肽作為免疫原制備氣單胞菌交叉型抗體具有較好的可行性。

圖2 嗜水氣單胞菌OmpF與氣單胞菌屬菌株的序列同源性分析

2.2 表達(dá)載體pET-28a（+）-OmpF的鑒定

試驗(yàn)前期研究中從嗜水氣單胞菌基因組DNA擴(kuò)增OmpF開(kāi)放閱讀框（ORF）基因片段，上游引物為：CGCGGATCCGTGGTTTATGACAAAGACGG，下游引物為：CCCAAGCTTTTAGAAGTTGTATTGC。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)與嗜水氣單胞菌BA1外膜蛋白Aha1（ahal）基因符合度為99%，與OmpF符合度低于90%，說(shuō)明PCR擴(kuò)增并插入的基因?yàn)锳ha1。經(jīng)BLAST后發(fā)現(xiàn)，OMP Aha1同與OmpF相似性為83%，在蛋白起始和末端序列高度一致，這給PCR擴(kuò)增OmpF基因帶來(lái)了一定困難。因此，由上海生工生物全合成OmpF ORF基因，插入重組質(zhì)粒pET-28a（+）后經(jīng)雙酶切得到一條5 000 bp左右和1 000 bp左右的片段（圖3-A），與預(yù)期的質(zhì)粒（5 300 bp）和目的片段（994 bp）的大小一致，同時(shí)測(cè)序結(jié)果說(shuō)明插入基因?yàn)镺mpF ORF基因，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 重組OmpF蛋白的鑒定與誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將誘導(dǎo)的菌體超聲裂解，分離上清和沉淀后進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果（圖3-B）表明，37℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)過(guò)夜，超聲破碎的沉淀樣品在40 kD左右出現(xiàn)明顯條帶，誘導(dǎo)后上清中未見(jiàn)目標(biāo)條帶。未誘導(dǎo)的表達(dá)上清和沉淀中均未出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明重組蛋白OmpF在誘導(dǎo)后以包涵體的形式進(jìn)行了表達(dá)。

為提高OmpF的可溶性表達(dá)，對(duì)IPTG濃度、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明在25℃，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h，IPTG濃度為0.2 mmol/L時(shí)，超聲破碎的上清中目標(biāo)條帶的量相對(duì)其他條件更多，隨著IPTG濃度繼續(xù)上升上清和沉淀中的目標(biāo)條帶均沒(méi)有明顯增加（圖4-A），上清中OmpF表達(dá)量仍占比很低。IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h時(shí)，隨著誘導(dǎo)溫度的提高，表達(dá)量也隨之增加，到28℃時(shí)上清和沉淀中的目標(biāo)條帶表達(dá)量不再明顯增加（圖4-B），OmpF表達(dá)仍以包涵體為主；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L時(shí)，隨著表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量有所增加，當(dāng)表達(dá)時(shí)間達(dá)到12 h后表達(dá)量不再增加，而且不同誘導(dǎo)時(shí)間下上清的OmpF表達(dá)量均非常低，仍主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。以上結(jié)果表明，通過(guò)優(yōu)化IPTG濃度、培養(yǎng)溫度，重組蛋白OmpF可溶性表達(dá)有一定的增加，但后續(xù)純化試驗(yàn)表明低豐度的可溶性O(shè)mpF進(jìn)行純化的難度較大，因此本研究確定采用OmpF包涵體進(jìn)行后續(xù)研究，其最佳誘導(dǎo)條件是：培養(yǎng)溫度28℃，IPTG濃度0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間12 h。

圖3 pET-28a（+）-OmpF重組表達(dá)載體雙酶切鑒定（A）pET-28a（+）-OmpF重組表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE驗(yàn)證（B）

2.4 OmpF包涵體初步純化與Western blot鑒定

運(yùn)用最佳誘導(dǎo)條件大量誘導(dǎo)表達(dá)并收集超聲破碎后的沉淀，即為包涵體蛋白。該包涵體蛋白經(jīng)過(guò)尿素梯度法復(fù)性到2 mmol/L尿素濃度后隨即發(fā)生沉淀，難以復(fù)性。隨后采用Ni柱進(jìn)行純化時(shí)發(fā)現(xiàn)包涵體蛋白無(wú)法掛柱，由于沉淀物中OmpF蛋白的純度相對(duì)較高，因此采用洗滌純化的方法對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果（圖5-A）顯示，通過(guò)3次純化洗滌緩沖液的洗滌可以去除一些細(xì)胞碎片和雜蛋白，最終得到純度較高的OmpF包涵體蛋白。采用實(shí)驗(yàn)室前期制備的識(shí)別OmpF保守性多肽的單克隆抗體1B1對(duì)制備的OmpF包涵體蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果（圖5-B）顯示在40 kD處出現(xiàn)特異性的目的條帶，說(shuō)明制備的包涵體蛋白為氣單胞菌OmpF蛋白。

圖4 不同梯度IPTG濃度（A）、誘導(dǎo)溫度（B）下，菌體破碎離心后上清和沉淀樣品的電泳圖

2.5 重組OmpF蛋白免疫血清評(píng)價(jià)

圖5 包涵體蛋白的純化過(guò)程表征（A）與Western blot鑒定（B）

采用間接ELISA方法檢測(cè)重組蛋白OmpF免疫的小鼠血清。圖6表示的是10只小鼠血清對(duì)煮沸滅活的氣單胞菌的平均吸光值隨血清稀釋倍數(shù)的變化曲線(xiàn)。由圖可以看出，免疫的小鼠血清對(duì)嗜水氣單胞菌CICC 10500、嗜水氣單胞菌CICC 10868、嗜水氣單胞菌MCCC 1A00190、維氏氣單胞菌MCCC 1K03237、波氏氣單胞菌CGMCC 1.9063、豚鼠氣單胞菌MCCC 1A12231、斑點(diǎn)氣單胞菌CGMCC 1.1960、雙殼氣單胞菌MCCC 1A02126、肇東氣單胞菌MCCC 1A12437有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，平均效價(jià)在1∶81 000，對(duì)嗜水氣單胞菌MCCC 1A0007的效價(jià)稍弱，對(duì)氣單胞菌CICC 23565基本無(wú)交叉反應(yīng)。血清對(duì)氣單胞菌屬外的創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、地衣芽孢桿菌沒(méi)有交叉反應(yīng)，但血清與遲緩愛(ài)德華氏菌出現(xiàn)較強(qiáng)的交叉反應(yīng)。

圖6 OmpF包涵體免疫小鼠血清對(duì)氣單胞菌屬內(nèi)外菌株的交叉反應(yīng)

ELISA結(jié)果表明重組OmpF包涵體免疫的小鼠血清對(duì)測(cè)試的11株氣單胞菌中的10株具有交叉反應(yīng)，包括4株不同的嗜水氣單胞菌及6株常見(jiàn)的氣單胞菌，說(shuō)明OmpF蛋白的免疫血清對(duì)氣單胞菌屬菌株具有較好的交叉反應(yīng)，僅對(duì)1株氣單胞菌無(wú)法識(shí)別，這與生物信息學(xué)分析得出的氣單胞菌屬內(nèi)OmpF蛋白相似性較高保持一致。屬外的交叉反應(yīng)測(cè)試表明與免疫血清對(duì)氣單胞菌屬的特異性較好。

3 討論

氣單胞菌是淡水魚(yú)類(lèi)重要的條件致病菌，每年因其感染所引起的出血性敗血癥給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5-6]。近年來(lái)的研究表明，除了嗜水氣單胞菌，維氏氣單胞菌等其他氣單胞菌也是引起魚(yú)類(lèi)敗血癥的主要病原。此外，氣單胞菌也是一種人類(lèi)條件致病菌，可以引起人類(lèi)腹瀉和軟組織感染等疾病。因此，目前水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品領(lǐng)域及臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，亟需針對(duì)氣單胞菌屬的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)方法，用于魚(yú)類(lèi)敗血癥預(yù)警、保障食品安全及病原檢測(cè)。然而，氣單胞菌屬內(nèi)致病菌種較多，目前缺乏準(zhǔn)確的快速檢測(cè)方法。免疫快速檢測(cè)方法是常用的致病菌快速檢測(cè)方法之一，其準(zhǔn)確性主要取決于抗體的交叉反應(yīng)和親和力。因此，氣單胞菌共同抗原的研究對(duì)制備氣單胞菌屬交叉型抗體、進(jìn)行流行氣單胞菌的快速免疫檢測(cè)具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外氣單胞菌診斷抗體的制備主要依賴(lài)菌體抗原進(jìn)行免疫，而菌體抗原由于表面抗原種類(lèi)繁多、豐度不一，因此篩選的抗體多為菌株或血清型特異性抗體，難以對(duì)主要?dú)鈫伟M(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)。黃藝丹等［22]采用豚鼠氣單胞菌抗原制備了豚鼠氣單胞菌單克隆抗體并建立了豚鼠氣單胞菌特異性膠體金試紙檢測(cè)方法。馬麗等［23]采用點(diǎn)狀氣單胞菌菌體免疫制備了點(diǎn)狀氣單胞菌特異性抗體并建立了雙抗體夾心ELISA方法，該方法與點(diǎn)狀氣單胞菌強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，與近似菌無(wú)交叉反應(yīng)。很多研究表明，外膜蛋白具有良好的免疫原性，部分外膜蛋白具有較高的屬內(nèi)同源性，是制備生物識(shí)別材料以及亞單位疫苗的良好抗原。劉明智等［24]表達(dá)純化了嗜水氣單胞菌OmpW包涵體，用此蛋白免疫草魚(yú)，所得草魚(yú)血清經(jīng)ELISA 分析顯示呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明該重組蛋白能誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生抗體。蔣蔚等［25]表達(dá)純化了嗜水氣單胞菌OmpA，經(jīng)此蛋白免疫后的兔血清可與 8株不同血清型的嗜水氣單胞菌及殺鮭氣單胞菌總蛋白發(fā)生特異性免疫印跡反應(yīng)，說(shuō)明該外膜蛋白具有很好的免疫原性，并可能是嗜水氣單胞菌的共同保護(hù)抗原。

本研究首先分析了嗜水氣單胞菌OmpF蛋白的基本結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其為同源三聚體組成的孔蛋白，部分結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜外具有暴露性，可以用于免疫動(dòng)物制備氣識(shí)別氣單胞菌體的抗體。通過(guò)Blast比較嗜水氣單胞菌OmpF與氣單胞菌屬內(nèi)外菌株的同源性發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌OmpF屬內(nèi)同源性較高，在多個(gè)區(qū)域的氨基酸序列同源性大于85%，與屬外常見(jiàn)細(xì)菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等的同源性低于30%，說(shuō)明氣單胞菌OmpF蛋白具有較好的氣單胞菌特異性，適合用于制備氣單胞菌屬交叉型抗體。本研究構(gòu)建了pET-28a（+）-OmpF重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)表達(dá)溫度、IPTG濃度等表達(dá)條件優(yōu)化后，重組蛋白OmpF主要以包涵體的形式表達(dá)。采用洗滌純化的OmpF包涵體蛋白免疫小白鼠，ELISA結(jié)果顯示免疫后小鼠血清與11株氣單胞菌中的10株氣單胞菌（10/11）有特異性交叉反應(yīng)，包括4株嗜水氣單胞菌以及維氏氣單胞菌、波氏氣單胞菌、斑點(diǎn)氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、雙殼氣單胞菌、肇東氣單胞菌，對(duì)4株弧菌和地衣芽孢桿菌沒(méi)有交叉反應(yīng)，但與遲緩愛(ài)德華氏菌有強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。經(jīng)過(guò)比對(duì)，氣單胞菌OmpF與遲緩愛(ài)德華氏菌的同源性?xún)H在27%-30%之間，存在交叉的原因可能是包涵體的純度不高，具體有待進(jìn)一步驗(yàn)證。以上結(jié)果說(shuō)明OmpF重組蛋白可以用于免疫小鼠制備氣單胞菌廣泛交叉的抗體，為建立氣單胞菌免疫快速檢測(cè)方法提供了技術(shù)保障。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)免疫血清對(duì)煮沸滅活的氣單胞菌有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而對(duì)氣單胞菌活菌無(wú)識(shí)別作用，說(shuō)明抗體識(shí)別的包涵體蛋白結(jié)構(gòu)與天然蛋白構(gòu)象存在較大差異。因此，如果采用OmpF包涵體作為疫苗，對(duì)魚(yú)進(jìn)行病害防護(hù)的效果可能不佳，該發(fā)現(xiàn)與目前國(guó)內(nèi)其他魚(yú)類(lèi)OmpF亞單位疫苗的保護(hù)效果評(píng)價(jià)結(jié)果保持一致。秦楊蕾［26]采用PET30a（+）重組表達(dá)了鱉源嗜水氣單胞菌4個(gè)主要外膜蛋白Omp38、OmpTS、OmpF和Aha1，4種蛋白均以包涵體的形式表達(dá)。中華鱉經(jīng)過(guò)免疫、攻毒后發(fā)現(xiàn)Omp38、OmpTS的保護(hù)率在70%，而OmpF和Aha1為20%-30%。廖紫超［27]發(fā)現(xiàn)鰻鱺感染嗜水氣單胞菌后的恢復(fù)期血清可以與表達(dá)豐度最高的37 kD蛋白以及5株菌株共有的28 kD蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，后經(jīng)質(zhì)譜鑒定分別為OmpF和OmpK。經(jīng)重組表達(dá)后免疫鰻鱺及攻毒嗜水氣單胞菌（5×106CFU/尾）發(fā)現(xiàn)OmpF的保護(hù)率為35.3%，OmpK的免疫保護(hù)率為70%。

4 結(jié)論

本研究首先通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)及Blast等說(shuō)明嗜水氣單胞菌OmpF與氣單胞菌屬外膜蛋白的相似性較高，是潛在的氣單胞菌屬檢測(cè)靶點(diǎn)。隨后構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-28a（+）-OmpF，誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化表明重組OmpF蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。采用純化的包涵體免疫BALB / c小鼠，結(jié)果表明小鼠血清與11株氣單胞菌中的10株氣單胞菌（10/11）均有交叉反應(yīng)，包括4株嗜水氣單胞菌和多種常見(jiàn)的氣單胞菌，與副溶血性弧菌、哈維氏弧菌、地衣芽孢桿菌等無(wú)交叉反應(yīng)。結(jié)果表明氣單胞菌OmpF蛋白可以用于制備氣單胞菌屬交叉型單克隆抗體。