范宇欣 沈紅英 梁雁寧 楊洋 陳凱陽 林欣大

摘 ?要：纖維素酶來源廣泛，其中微生物繁殖快、發(fā)酵周期短，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。通過采用理化誘變，原生質(zhì)體融合，基因工程等技術(shù)可進(jìn)一步篩選出高產(chǎn)纖維素酶的菌種。該文綜述了目前關(guān)于產(chǎn)纖維素酶菌的研究進(jìn)展，并對常用的篩選改良菌種的方法進(jìn)行分別闡述，對比各方法間的優(yōu)勢和局限性，以期為后續(xù)研究者提供一些參考。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)纖維素酶菌 ?纖維素酶 ?理化誘變 ?酶活力

中圖分類號：Q93-31 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? 文章編號：1672-3791（2019）06（c）-0187-02

Abstract： Cellulase has a wide range of sources， and microbial fermentation is more suitable for large-scale production because of its rapid reproduction and short cycle. High cellulase-producing strains can be further screened by physical and chemical mutagenesis， protoplast fusion and genetic engineering. This review summarized the current research progress on cellulase-producing strains， and elaborates the commonly used methods of optimizing and screening improved strains， comparing the advantages and limitations of each method， in order to provide some reference for the future researchers.

Key Words： Cellulase-producing strains; Cellulose; Physical and chemical mutagenesis; Cellulase activity

纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶系，可將天然的纖維素降解成為小分子的糖類。在農(nóng)業(yè)廢棄物處理、食品加工、紡織、造紙業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用價值。

目前已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶菌眾多，但從自然界中直接分離到的產(chǎn)纖維素酶菌通常產(chǎn)酶量少、活性低，一般無法直接應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)，因此常需要定向優(yōu)化篩選，分離得到產(chǎn)酶量高且酶活力更加穩(wěn)定的最優(yōu)化型菌株，從而減少生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)室通常采用理化誘變、原生質(zhì)體融合以及構(gòu)建基因工程菌等方法進(jìn)行菌株的改良，可顯著提高菌株的產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶活性。

1 ?產(chǎn)纖維素酶菌

1.1 產(chǎn)纖維素酶菌的分離

自1912年Kellerma等首次從土壤中篩選出一株纖維素降解菌以來，各種降解纖維酶的菌種陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[1]，主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌等。其中大多數(shù)的菌株主要從土壤中獲得，此外食草動物的糞肥、秸稈、蘑菇基質(zhì)等也可分離出產(chǎn)纖維素酶菌。

1.2 產(chǎn)纖維素酶菌的產(chǎn)酶特點(diǎn)

不同菌種纖維素酶的產(chǎn)生和作用方式有所不同，如細(xì)菌纖維素酶是胞表面酶，降解纖維素時需要細(xì)菌粘附在纖維素上，而真菌和放線菌則為胞外酶，不需要直接與纖維素接觸即可在胞外環(huán)境通過水解酶機(jī)制和氧化機(jī)制來降解纖維素。細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶一般需要在最適pH為中性至偏堿性環(huán)境下發(fā)揮作用，而真菌產(chǎn)生的纖維素酶一般則需要在偏酸性的環(huán)境下發(fā)揮作用。大部分產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌為厭氧型，通過纖維素酶復(fù)合體的協(xié)同作用降解纖維素。放線菌產(chǎn)纖維素酶則大多數(shù)具有耐高溫和耐堿性的特點(diǎn)。

2 ?產(chǎn)纖維素酶菌的優(yōu)化篩選方法

2.1 理化因素誘變篩選

2.1.1 ?化學(xué)誘變

化學(xué)誘變主要通過使用亞硝基胍、硫酸二乙酯、羥胺等誘變劑對菌株進(jìn)行處理來引起菌株基因突變，一般采用兩種或兩種以上誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理，增強(qiáng)誘變效果。如李希波等[2]用亞硝基胍和羥胺復(fù)合誘變青霉HK-003，篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶菌株LX-435，產(chǎn)酶能力較原始菌株提高了2.08倍。

2.1.2 ?物理誘變

物理誘變主要包括紫外線照射、激光照射、微波、高能電子流照射、離子流注入等。

紫外線照射是通過使DNA分子形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對，從而引起突變，是實(shí)驗(yàn)室常用的誘變篩選方法。通常為了提高紫外照射的突變率，也常采用原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)。

激光誘變則是利用激光輻射的光、電、磁等的綜合效應(yīng)使菌株細(xì)胞DNA處于易突變的狀態(tài)，再經(jīng)歷一系列斷鍵、聚合、交聯(lián)等的變化來產(chǎn)生突變。通常采用低功率長脈沖的氦氖激光，但傳統(tǒng)的He-Ne激光誘變方法易損傷細(xì)胞，突變效率較低。飛秒激光具有脈沖持續(xù)時間短（10-15s）、瞬時功率大（1012W）、聚焦尺寸?。s200nm）的特點(diǎn)[3]，目前在微生物的誘變篩選中已經(jīng)得以應(yīng)用，但未見有報道用于產(chǎn)纖維素酶菌的誘變篩選。

高能電子流可引起菌種體內(nèi)原子或分子的激發(fā)和電離，可以使菌種的遺傳信息發(fā)生改變，引起突變[4]。離子注入則是通過離子注入設(shè)備將經(jīng)高能加速的離子注入到菌體內(nèi)來引起突變，目前常使用低能氮離子。

2.1.3 理化復(fù)合誘變

目前很多研究表明，將化學(xué)誘變與物理誘變方法結(jié)合可以提高正向突變率，例如蘭時樂[5]等以綠色木霉突變株TP1202為出發(fā)菌株，用微波誘變和硫酸二乙酯、氯化鋰誘變劑進(jìn)行誘變，選育到1株纖維素酶高產(chǎn)菌株AS5，在適宜條件下，它產(chǎn)生的CMC酶活力和濾紙酶活力分別是出發(fā)菌株的107%和152.4%。

2.2 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合主要是通過使用酶制劑將具有不同優(yōu)良性狀或在生物代謝功能上可以互補(bǔ)的兩個菌株的細(xì)胞壁去除獲得原生質(zhì)體，并將其混合后通過助溶劑或電場作用互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合以實(shí)現(xiàn)遺傳重組。采用原生質(zhì)體融合沒有受體和供體之分，既有核配又有質(zhì)配，因此可以在很大程度上保留雙親基因組的完整性。

為了提高已篩選出的產(chǎn)纖維素酶菌的產(chǎn)酶能力，也常采用原生質(zhì)體融合的方法將兩株產(chǎn)纖維酶菌進(jìn)行融合，但此種方法也具有一定局限性，目前一般只能用于兩種菌的融合，且在融合的過程中隨機(jī)性很大，融合過程不易于觀察，同時在融合子的分離上也比較困難。不過隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，原生質(zhì)體融合技術(shù)在改良菌種性狀和優(yōu)化篩選方面也將發(fā)揮更大的作用。

2.3 基因工程技術(shù)

目前纖維素酶的需求量越來越高，為了更加快速地獲得纖維素酶，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，人們更加傾向于利用基因工程技術(shù)將纖維素酶的基因克隆到酵母、大腸桿菌等載體中，可在較短的時間內(nèi)獲得高酶活力的重組型纖維素酶。

纖維素酶的基因克隆從20世紀(jì)70年代開始，迄今為止，已經(jīng)從近百個物種中克隆出纖維素酶基因，其中大多數(shù)來自于真菌和細(xì)菌。目前，對于里氏木霉基因研究較為深入，已克隆到了里氏木霉所編碼纖維素酶的13個基因[6]。

但由于纖維素酶的復(fù)雜體系，基因工程技術(shù)仍具有局限性，所得到的酶一般為纖維素酶復(fù)合體的單個多肽組分，只具有幾種纖維素酶的功能，不足以徹底降解纖維素，因此運(yùn)用該技術(shù)獲得完全的纖維素酶，并提高酶的活性仍具有一定的挑戰(zhàn)性。

3 ?結(jié)語

優(yōu)化篩選高產(chǎn)酶量的菌株，尋找合適的發(fā)酵工藝，探索使酶活更穩(wěn)定的方法，是降解纖維素的當(dāng)務(wù)之急。而在眾多的優(yōu)化篩選方法中，理化因素誘變篩選相對于其他方法的操作更為簡便，但往往對于菌種的致死率高，正向突變率低，以及很多誘變劑都存在毒性甚至致畸變，對于操作人員的安全存在威脅，原生質(zhì)體融合和基因工程技術(shù)則危險系數(shù)相對較低，但同時也有其缺點(diǎn)，因此需根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件以及研究目標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化篩選方法的確定。

參考文獻(xiàn)

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