彭山珊

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）已經(jīng)成為全球主要慢性病之一及我國重要的公共衛(wèi)生問題，但尚缺乏理想的防治措施。在網(wǎng)上查詢的時候，我發(fā)現(xiàn)了一種天然植物——莓茶，莓茶產(chǎn)地分布在長江流域以南，如湖北西南部、云南東南部、福建、廣西、廣東、湖南等地，“長壽之鄉(xiāng)”廣西巴馬也盛產(chǎn)莓茶。網(wǎng)上提到莓茶的保健功能有很多，尤其聲稱脂肪肝患者長期飲用有明顯的效果?！拜枋欠袢缇W(wǎng)上所描述的那樣可以緩解脂肪肝和減輕肝纖維化？”帶著這個問題，我開始了本課題的研究。

膳食營養(yǎng)干預(yù)在慢性病防治中的重要作用已被廣泛關(guān)注，特別是植物性食物在慢性疾病防治中的作用日益凸顯。研究發(fā)現(xiàn)，一些多酚類化合物能夠改善NAFLD患者肝脂肪變，抑制炎性反應(yīng)，延緩NAFLD疾病進程。二氫楊梅素（DHM）又名蛇葡萄素，屬于多酚類中的黃酮類化合物，在天然植物莓茶中含量甚高，在嫩莖葉中含量高達30%以上（以干重計），遠遠高于莓茶中其他黃酮類化合物。因此，二氫楊梅素是莓茶中的主要天然活性成分。結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究進展，我們率先提出了“莓茶可能防治NAFLD”的理論假說，并推測莓茶的健康功效可能主要與“二氫楊梅素改善肝臟脂質(zhì)代謝和調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)產(chǎn)生”有關(guān)。

為闡明這一理論假說，我們擬利用高脂誘導的動物模型，研究二氫楊梅素對NAFLD發(fā)生中脂代謝及肝纖維化的作用，并進一步通過細胞實驗，研究二氫楊梅素對肝星狀細胞分泌的細胞外基質(zhì)的影響，并闡明腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/Smad介導的相關(guān)信號通路在其中的作用。本課題研究結(jié)果將為NAFLD防治提供新的膳食營養(yǎng)干預(yù)策略。@實驗方法

取8周齡的雄性129野生型小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，干預(yù)持續(xù)12周。①SD組：給予基礎(chǔ)飼料;②HFD組：給予高脂飼料;③HFD+DHM組：給予含有0.6%DHM的高脂飼料（相當于）;④DHM組：給予含有0.6%DHM的基礎(chǔ)飼料。

利用高脂膳食誘導小鼠建立動物模型，檢測二氫楊梅素（DHM）干預(yù)后對肝臟脂質(zhì)沉積、血脂譜、肝臟炎癥、肝纖維化發(fā)生等的影響;利用大鼠原代肝星狀細胞及肝星狀細胞株HSC T6，DHM干預(yù)后，CCK 8法檢測細胞活力;Annexin V FITC/PI染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期;免疫細胞化學法檢測活化蛋白a-SMA的表達;ELISA法檢測細胞外基質(zhì)COL-I、COL-III、TIMP-1及MMMP-1產(chǎn)生水平;qRT-PCR和We.stem Blot分別檢測AMPK、Smad家族蛋白及細胞外基質(zhì)基因mRNA和蛋白的表達;進而利用AMPK激動劑（AICAR）和AMPK抑制劑（CompoundC）及AMPK和Smad7的siRNA干預(yù)HSC-T6細胞株，qRT-PCR和We.stem Blot法分別檢測細胞外基質(zhì)及相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達。

主要實驗結(jié)果

二氫楊梅素能夠改善肝臟脂代謝及延緩高脂誘導的NAFLD進程

通過建立高脂誘導小鼠模型，DHM干預(yù)后能夠顯著抑制小鼠體重增加，減少肝臟脂肪蓄積（圖1），改善血脂譜，減輕肝臟炎癥損傷和抑制肝谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平升高（圖2），并能夠改善肝纖維化程度（圖3）。結(jié)果表明：DHM能夠改善肝臟脂代謝及延緩高脂誘導的NAFLD進程。

二氫楊梅素能夠顯著抑制肝星狀細胞活化并調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)水平，可能與其對Smads蛋白表達的調(diào)節(jié)作用有關(guān)

利用轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1誘導原代肝星狀細胞（HSC）和HSC-T6細胞株建立細胞模型，DHM處理后能明顯抑制TGF-β1誘導的原代HSC細胞和HSC-T6細胞株的增殖活化，調(diào)節(jié)細胞周期，促進細胞凋亡，降低COL-I和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP 1及增加基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1等細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，降低肝星狀細胞內(nèi)a-平滑肌肌動蛋白（a-SMA）的表達。同時，DHM還能抑制TGF-β1誘導的COL-I、Smad3、Smad4的mRNA表達水平增加及MMP-1和Smad7的mRNA表達水平降低。最后DHM能抑制TGF-β1對HSC-T6細胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白表達的影響。

二氫楊梅素通過促進AMPK磷酸化及Smad7表達，進而抑制Smad4表達和Smad2/3磷酸化，最終減少TGF-β1誘導的HSC中ECM分泌和HSC活化

采用AMPK抑制劑或siRNA分別抑制或沉默AMPK表達后，DHM對TGF-β1誘導的HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4和Smad7蛋白表達的影響被抑制;而利用AMPK激動劑AICAR預(yù)處理后，DHM能夠協(xié)同AICAR促進AMPK磷酸化、減少Smad2/3的磷酸化和Smad4蛋白表達及增加Smad7蛋白表達水平。以上結(jié)果提示：AMPK在介導DHM對TGF-β1誘導HSC細胞內(nèi)Smad2/3磷酸化及Smad4和Smad7表達的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。利用siRNA沉默Smad7基因表達后，DHM對TGF-β1誘導的HSC-T6細胞中COL-I、COL-III和TIMP-1 mRNA表達的抑制及對MMP 1 mRNA的促進作用被削弱，提示Smad7在DHM調(diào)節(jié)HSC細胞ECM的mRNA表達中起關(guān)鍵作用。

結(jié)論

二氫楊梅素能夠調(diào)節(jié)肝臟脂代謝，減少肝脂質(zhì)沉積及改善NAFLD肝纖維化，并可能通過AMPK/Smad信號通路抑制肝星狀細胞活化及調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)水平，延緩NAFLD進程。

創(chuàng)新性

本課題率先提出“莓茶可能具有防治NAFLD的功效”的理論假說，并通過動物實驗和細胞實驗發(fā)現(xiàn)莓茶中的主要天然活性成分二氫楊梅素具有改善肝臟脂代謝、減少肝脂質(zhì)沉積及調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的作用。研究結(jié)果證實了本課題的理論假說。

本研究通過實驗研究，率先發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素能夠改變高脂誘導動物的血脂譜，減少肝臟脂質(zhì)沉積和炎性反應(yīng)，延緩肝纖維化進程，并可能通過促進肝星狀細胞AMPK磷酸化及Smad7表達，進而抑制Smad4表達和Smad2/3磷酸化，最終調(diào)節(jié)TGF-β1誘導的細胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)產(chǎn)生。研究結(jié)果初步闡明了二氫楊梅素調(diào)節(jié)脂代謝和細胞外基質(zhì)的作用機制，為其防治NAFLD提供了科學依據(jù)。

小結(jié)

二氫楊梅素是天然植物莓茶中富含的主要多酚類植物化學物，來源經(jīng)濟方便，人體食用安全。本課題為NAFLD人群（包括NAFLD肝纖維化患者）提供了新的膳食營養(yǎng)干預(yù)策略。

本課題研究為莓茶的保肝和抗纖效果提供了科學依據(jù)，同時為基于莓茶的功能性食品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本課題初步揭示了二氫楊梅素的作用分子機制，為NAFLD防治研究提供了新的研究思路和干預(yù)靶點。