劉春都,朱葉飛

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，南京 210011； 2.南京市浦口醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210031)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)廣泛分布于自然界，為條件致病菌，是醫(yī)院及社區(qū)感染中較常見(jiàn)的病原菌，可引起多種感染性疾病，尤其是在免疫功能低下或缺陷的患者中感染更為常見(jiàn)，甚至還危及生命[1]。近年來(lái)，由于各種器械性和侵入性治療手段，以及抗菌藥物的廣泛使用，其耐藥率不斷上升。2017年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，PA的分離率在革蘭陰性菌中為第4位，在非發(fā)酵菌中為第2位，對(duì)抗生素的耐藥率不斷升高[2]。PA的耐藥性愈加嚴(yán)重，引起PA的耐藥機(jī)制也非常復(fù)雜，其中PA生物膜的形成是PA產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制。據(jù)報(bào)道，醫(yī)院獲得性感染中30%是由PA引起，并且它極易形成生物膜，易對(duì)患者造成慢性持續(xù)性感染[3]。研究表明，65%～80%的人類細(xì)菌感染與生物膜有關(guān)，細(xì)菌的生物膜態(tài)對(duì)抗菌藥物的耐藥性顯著高于浮游態(tài)[4]。本研究通過(guò)建立體外PA生物膜模型,比較生物膜態(tài)與游離態(tài)PA對(duì)抗菌藥物的耐藥性，為臨床上預(yù)防和治療生物膜感染提供思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 收集2017年1—12 月南京市浦口醫(yī)院細(xì)菌室分離、鑒定的63株P(guān)A，所有菌株均按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[5]的要求，分離、培養(yǎng)并經(jīng)VITEK-60 微生物儀鑒定。去除相同部位的重復(fù)菌株?？剖曳植迹褐匕Y監(jiān)護(hù)病房30株，腫瘤科11株，呼吸內(nèi)科9株，老年科6株，消化內(nèi)科3株，血液科2株，內(nèi)分泌科2株；標(biāo)本來(lái)源：痰液34株，尿液10株、血液6株、膿液4株、分泌物4株、導(dǎo)管3株及膽汁2株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2培養(yǎng)基 溶菌肉湯、水解酪蛋白培養(yǎng)基均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)。

1.1.3試劑與儀器 0.1%結(jié)晶紫溶液、95%乙醇、磷酸鹽緩沖液、藥敏試劑和藥敏紙片(購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司)、96孔平板，SpectramaxM3酶標(biāo)儀、漩渦混合器、VITEK-60微生物鑒定系統(tǒng)(購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司)。

1.2方法

1.2.1PA復(fù)溶、增菌 將臨床分離的PA從低溫冰箱中取出解凍并接種于血平板，37 ℃過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 18～24 h培養(yǎng)增菌。

1.2.2PA生物膜體外構(gòu)建 用標(biāo)準(zhǔn)比濁儀將增菌培養(yǎng)的PA調(diào)節(jié)成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛?，?0 μL加入96孔板中(每孔含1∶50稀釋的LB培養(yǎng)液200 μL)。每株菌做3個(gè)復(fù)孔，3個(gè)空白孔(不加菌液)，37 ℃培養(yǎng)72 h，每24小時(shí)更換溶菌肉湯培養(yǎng)液一次。

1.2.3結(jié)晶紫染色 細(xì)菌培養(yǎng)72 h后，在每個(gè)平板孔中加入150 μL 0.1%的結(jié)晶紫染液染色15 min，用緩沖液沖洗3次后晾干，每孔再加入95%乙醇150 μL脫色2 min[6]。

1.2.4生物膜定量檢測(cè)及判斷標(biāo)準(zhǔn) 用酶標(biāo)儀測(cè)定每株菌的復(fù)孔OD570，對(duì)照管吸光度(comparison optical density,ODC)定義為空白對(duì)照孔的平均OD，加上標(biāo)準(zhǔn)差s,即ODC=OD空白+1s[7-8]。當(dāng)待測(cè)菌OD值(OD測(cè))≤ODC時(shí)，則無(wú)生物膜形成；當(dāng)OD測(cè)>ODC時(shí)，則此菌株有生物膜形成。

1.2.5紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn) 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[5]的要求，用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行PA浮游態(tài)及生物膜態(tài)的藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果依照2010年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥情況[9]。

1.2.6PA浮游菌最小抑菌濃度和PA生物膜菌最小生物膜清除濃度的測(cè)定 將臨床常用的阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、環(huán)丙沙星12種抗菌藥物分別在96孔板上采用微量稀釋法測(cè)定浮游菌的最小抑菌濃度(即能抑制PA生長(zhǎng)的最小藥物濃度)：對(duì)形成生物膜的PA，在去除浮游菌后，在超聲波震蕩作用下，混勻器充分混勻后，微量稀釋法測(cè)定最小生物膜清除濃度(即能清除PA生物膜的最小抗菌藥物濃度)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1生物膜形成定量測(cè)定 將臨床分離、培養(yǎng)、鑒定、收集的63株P(guān)A菌株經(jīng)過(guò)96孔微量平板72 h培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色法定量檢測(cè)每株菌的OD值，結(jié)果有1株菌的ODODC形成生物膜，占98.4%。

2.2浮游態(tài)與生物膜態(tài)PA的耐藥率 生物膜態(tài)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、環(huán)丙沙星的PA耐藥率均高于浮游態(tài)(P<0.01)，浮游態(tài)PA耐藥率最低的是阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦，而生物膜態(tài)PA耐藥率最低的是阿米卡星，其他均高于50%，其中最高的兩種分別是對(duì)氨曲南和替卡西林/克拉維酸。見(jiàn)表1。

表1 浮游態(tài)與生物膜態(tài)PA藥敏試驗(yàn)?zāi)退幝时容^ [株數(shù)(%)]

PA：銅綠假單胞菌

2.3PA對(duì)抗菌藥物的最小抑菌濃度、最小生物膜清除濃度的值 生物膜態(tài)PA的最小生物膜清除濃度值與相應(yīng)的浮游態(tài)PA的最小抑菌濃度值相比明顯增大，氨曲南、亞胺培南和替卡西林、克拉維酸的最小生物膜清除濃度值均超過(guò)檢出限，生物膜菌最小生物膜清除濃度是浮游菌的10倍以上。見(jiàn)表2。

表2 PA浮游態(tài)最小抑菌濃度值與生物膜態(tài)最小生物膜清除濃度值 (n=62,μg/mL)

PA：銅綠假單胞菌

3 討 論

細(xì)菌的生物膜指細(xì)菌黏附于機(jī)體腔道或物體的表面時(shí)分泌的含有多種蛋白多糖的復(fù)合物,以藻酸鹽為主要成分的胞外多糖基質(zhì)[10-11]，細(xì)菌分泌的胞外基質(zhì)可將這些細(xì)菌粘連在一起形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的單種或多種細(xì)菌群體。生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，受到細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。密度感應(yīng)系統(tǒng)是指在形成生物膜的過(guò)程中，細(xì)菌分泌一些分子物質(zhì)到細(xì)胞外基質(zhì)中，當(dāng)達(dá)一定程度時(shí)就可激發(fā)一定的基因表達(dá)，這種情況就稱為密度感應(yīng)系統(tǒng)。PA有Las和Rhl兩個(gè)密度感應(yīng)系統(tǒng),其中Las系統(tǒng)由LasR和LasI兩個(gè)基因組成，Rhl系統(tǒng)由RhlR及RhlI基因組成[12-14]。細(xì)菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)與生物膜的形成密切相關(guān)，是生物膜形成過(guò)程中必不可少的。任何阻斷密度感應(yīng)系統(tǒng)的方法都可以阻止細(xì)菌生物膜的形成，這為治療生物膜態(tài)PA感染提供了一個(gè)新的有效方法。

本研究結(jié)果顯示，生物膜態(tài)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、環(huán)丙沙星的PA耐藥率均高于浮游態(tài)(P<0.01)，說(shuō)明患者感染PA后一些臨床常規(guī)的抗菌藥物對(duì)PA有一定的殺傷作用，患者感染PA的癥狀有所好轉(zhuǎn)，但隨著患者住院時(shí)間增加以及有些患者各種導(dǎo)管、支架、留置針等的使用，PA菌株就黏附在這些物體表面或患者本身的腔道表面，經(jīng)過(guò)反復(fù)的可逆黏附，PA菌株也不斷增加，接著進(jìn)入到不可逆黏附階段，PA菌株在附著部位越積越多，分泌的胞外基質(zhì)物質(zhì)也越來(lái)越多，聚集的這些物質(zhì)除細(xì)菌本身外，還含有水、細(xì)菌的代謝產(chǎn)物以及細(xì)菌變性、壞死、裂解的產(chǎn)物等，在多種因子的共同作用下，最后形成PA的生物膜。開(kāi)始形成的生物膜在密度感應(yīng)系統(tǒng)的作用下，膜中的細(xì)菌越來(lái)越緊密，膜本身也更加致密，最后形成成熟、穩(wěn)固、具有一定三維結(jié)構(gòu)的PA生物膜，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程[15-17]。

形成膜后的PA與浮游態(tài)的PA理化特點(diǎn)、生物學(xué)特征、基因構(gòu)型均有所不同(浮游態(tài)PA與生物膜態(tài)PA至少有45個(gè)基因不同)，致病性也不同[18-19]。本研究耐藥性試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)菌形成生物膜后耐藥性顯著提高。與浮游菌相比，生物膜菌的耐藥性大大提高，易引起難治性感染。常用的一些常規(guī)劑量的抗菌藥物不僅不能起到抗菌殺菌的作用，反而易引起耐藥性增加，給治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性的研究，特別是容易形成生物膜的PA的耐藥性研究具有現(xiàn)實(shí)意義[11]。

本研究結(jié)果還顯示，生物膜態(tài)PA的最小生物膜清除濃度值與相應(yīng)的浮游態(tài)PA的最小抑菌濃度值相比明顯增大，并且氨曲南、亞胺培南和替卡西林、克拉維酸的最小生物膜清除濃度值均超過(guò)檢出限?？梢?jiàn)PA形成生物膜后，其耐藥性明顯提高，說(shuō)明生物膜形成是PA極易產(chǎn)生耐藥的重要原因。生物膜產(chǎn)生耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，主要體現(xiàn)為以下幾點(diǎn)。①生物膜的阻擋作用：PA生物膜是以藻酸鹽為主要成分的多糖基質(zhì)，是具有空間結(jié)構(gòu)的聚集物，是細(xì)菌抵抗外界環(huán)境的天然屏障，也可以阻擋各種抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌從而起到耐藥作用。有學(xué)者通過(guò)光譜分析，觀察到環(huán)丙沙星滲透進(jìn)細(xì)菌生物膜的速度比滲透進(jìn)相應(yīng)浮游菌的速度降低顯著[2]。但機(jī)械性的阻擋作用顯然不是細(xì)菌生物膜耐藥性升高的主要原因。有文獻(xiàn)報(bào)道，氨芐青霉素可穿透有β-內(nèi)酰胺酶突變體的肺炎克雷伯菌的生物膜，但此菌仍對(duì)氨芐青霉素耐藥[20]。②生物膜基因表型的作用：細(xì)菌形成生物膜后，為了適應(yīng)周圍的環(huán)境，其生物學(xué)特性發(fā)生變化，形成了生物膜表型，原來(lái)抗菌藥物的靶細(xì)胞結(jié)合的靶位改變，使得抗菌藥物不能與它結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)耐藥性產(chǎn)生。③生物膜外排泵的作用：外排泵是位于膜上的一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，它可以將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗菌藥物排出胞外，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生。PA對(duì)第一代頭孢菌素、第二代頭孢菌素、頭孢曲松、氨芐西林等藥物天然耐藥，主要機(jī)制是這些藥物作用于PA時(shí)，使膜上的外排泵過(guò)度表達(dá)，藥物排出增多，進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物不能達(dá)到有效濃度，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生。④密度感應(yīng)系統(tǒng)的作用：密度感應(yīng)系統(tǒng)在生物膜的整個(gè)形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，保證生物膜的形成與降解平衡，保持整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程有序進(jìn)行。一旦密度感應(yīng)系統(tǒng)遭到破壞，生物膜的形成就會(huì)受到嚴(yán)重影響，該菌的生物學(xué)特性發(fā)生改變，耐藥性也會(huì)變化。⑤氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化：細(xì)菌一旦形成了生物膜，生物膜就將它緊緊裹住，生物膜的致密結(jié)構(gòu)阻礙了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，細(xì)菌的代謝產(chǎn)物不能排出去，而細(xì)菌生長(zhǎng)需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也不能轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)來(lái)，PA為了適應(yīng)環(huán)境生存下來(lái)，這些生物膜態(tài)的生物學(xué)性狀就會(huì)發(fā)生改變，因此這些PA的耐藥性也會(huì)變化。此外，膜上的位點(diǎn)、靶位、通道及酶發(fā)生改變對(duì)PA的耐藥性都有直接影響。隨著對(duì)細(xì)菌生物膜的深入研究還會(huì)有新的機(jī)制提出。同時(shí)生物膜對(duì)任何一種藥物的耐藥均是多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果[21]。

綜上所述，由于生物膜PA對(duì)臨床常規(guī)抗菌藥物的耐藥性嚴(yán)重，在臨床上應(yīng)盡量避免生物膜的形成，防止細(xì)菌生物膜的感染。對(duì)于使用器械性材料的病患應(yīng)該使用敏感的抗菌材料，抑制相應(yīng)的細(xì)菌黏附和生長(zhǎng)，阻止生物膜的形成，此外抑制細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，聯(lián)合用藥為當(dāng)前治療生物膜感染的重要方法，同時(shí)中草藥、物理、生物等方法也可用于臨床，防止生物膜形成[22]。