李成輝 劉代成 魯緒強(qiáng) 李 敏 尹成文

( 1)山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，251200，山東禹城; 2)山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，250014，濟(jì)南 )

低溫脫脂豆粕經(jīng)稀堿溶液提取后，可使大部分蛋白質(zhì)溶出，鹽酸調(diào)整浸提液pH值使蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)析出，分離得到蛋白質(zhì)凝乳，排出的則為大豆乳清水.蛋白質(zhì)凝乳經(jīng)中和、滅菌和噴霧干燥等得到大豆分離蛋白.向大豆乳清水中三次加入聚合氯化鋁和聚丙烯酰胺，鼓氣成一、二、三級(jí)泡沫，再經(jīng)捕沫、破泡和板框過(guò)濾得浮渣.因?yàn)楦≡兴郾０泛途酆下然X有一定毒性，只能燃燒，目前尚未開(kāi)發(fā)出其他用途.一個(gè)年產(chǎn)10萬(wàn)噸大豆蛋白的生產(chǎn)廠，大豆乳清水處理費(fèi)用約每年4 000多萬(wàn)元，嚴(yán)重制約公司發(fā)展.另外，處理后的大豆乳清水仍含有小分子的大豆異黃酮，于是這種具有雌激素作用的大豆異黃酮廢水排放后又變成了環(huán)境干擾素，干擾農(nóng)作物的生長(zhǎng)，進(jìn)而干擾動(dòng)物及人的生長(zhǎng)代謝.

據(jù)記載，大豆異黃酮有抗癌、抗心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、抗女性更年期綜合癥、抗老年性癡呆、抗機(jī)體免疫力下降、抗菌消炎、抗衰老等生理功能，是天然的植物保健品[1，2].美國(guó)、日本、德國(guó)和英國(guó)出現(xiàn)大豆異黃酮熱.將大豆乳清水浮渣中的大豆異黃酮提取純化成大豆異黃酮產(chǎn)品，不僅有利于健康，而且變廢為寶獲得良好經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)解決大豆蛋白生產(chǎn)廠所面臨的投資和環(huán)境問(wèn)題.

大豆乳清水浮渣是世界上從未研究利用過(guò)的新原料，從中提取、純化和生產(chǎn)大豆異黃酮，小試、中試和規(guī)?；笊a(chǎn)都需要首先建立一個(gè)大豆乳清水浮渣中大豆異黃酮的簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法.依檢測(cè)數(shù)據(jù)隨時(shí)判斷、指導(dǎo)小試、中試和生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，才能選取、優(yōu)化最佳工作參數(shù)和有效工作范圍等.因此，檢測(cè)方法為眾中之首、重中之重.

1 試驗(yàn)部分

1.1原料和儀器原料：大豆乳清水一級(jí)浮渣粉(山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司)；二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙酸、丙酮(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，分析純；黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元、染料木素(北京索萊寶科技有限公司)，色譜純.

儀器：恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市正基儀器有限公司)，HH-S型；薄層掃描儀(winCATS 1.4.4軟件)(瑞士CAMAG公司)，CAMAG TLC scanner III型；凝膠成像儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，JY02G型；EYELA-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA株式會(huì)社；GF254硅膠板(青島海洋化工有限公司)，10×20 cm.

1.2方 法

1.2.1 提取及樣品處理 將100 g大豆乳清水一級(jí)浮渣粉和700 mL丙酮加入蒸餾瓶，沸騰蒸餾1.5 h.濾紙過(guò)濾，濾液在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，干物質(zhì)量為0.62 g.

1.2.2 樣品溶液的配置 用乙酸乙酯將0.62 g樣品定容至3 mL,置于4 ℃?zhèn)溆?

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置 用甲醇分別將黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元定溶為1.58、1.18、1.09、0.32、1.38 mg/mL.用乙酸乙酯將染料木素定溶為1.04 mg/mL.

1.2.4 薄層層析掃描方法

1) 苷(黃豆黃苷，大豆苷，染料木苷).將樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)于同一塊高效薄層硅膠板GF254(10×20 cm)上，展開(kāi)劑(二氯甲烷∶甲醇∶乙酸=10∶2∶0.1)，預(yù)平衡20 min，將板放入展開(kāi)缸，上行展開(kāi)，展開(kāi)距：13 cm.

2)苷元(黃豆黃素，大豆苷元，染料木素).將樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)于同一塊高效薄層硅膠板GF254(10×20 cm)上，展開(kāi)劑(三氯甲烷∶甲醇∶乙酸=93∶7∶0.5)[6]，預(yù)平衡20 min，將板放入展開(kāi)缸，上行展開(kāi)，展開(kāi)距：13 cm.

掃描條件：掃描速度 80 nm/s，分辨率200 μm/step，照射燈D2燈，波長(zhǎng)260 nm，掃描寬度6.00×0.90 mm.

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，以梯度點(diǎn)樣量點(diǎn)于同一高效薄層硅膠板GF254(10×20 cm)上，以上述方法進(jìn)行展開(kāi)、掃描.以大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，由薄層色譜儀管理軟件winCATS 1.4.4直接得到線性回歸方程.

1.2.6 精密度測(cè)定 精密吸取樣品溶液10 μL，于同一高效薄層硅膠板GF254(10×20 cm)上點(diǎn)5個(gè)點(diǎn)，依照上述薄層層析掃描方法測(cè)得其峰面積積分值.

1.2.7 重復(fù)性測(cè)定 精密吸取10 μL樣品液，在5塊高效薄層硅膠板GF254(10×20 cm)上分別點(diǎn)樣，依照上述薄層層析掃描方法測(cè)得其峰面積積分值.

1.2.8 穩(wěn)定性測(cè)定 精密吸取10 μL樣品液，在高效薄層硅膠板GF254(10×20 cm)上點(diǎn)樣，依照上述薄層層析掃描方法測(cè)定0～12 h各部分峰面積積分值，每隔2 h測(cè)定一次.

圖1 黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、樣品3D掃描圖a:樣品中展開(kāi)距與大豆苷對(duì)應(yīng)峰，b:樣品中與黃豆黃苷、染料木苷對(duì)應(yīng)峰.

1.2.9 回收率 精密吸取已知異黃酮含量的樣品液3份，各10 μl，分別點(diǎn)于3塊高效薄層硅膠板GF254(10×20 cm)上，在3點(diǎn)上分別加大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(分別為樣品液含量的50%、100%、150%)，依照上述薄層層析掃描方法，記錄峰面積積分值，計(jì)算含量.

2 結(jié)果與討論

2.1六種大豆異黃酮和樣品的薄層掃描結(jié)果圖1可知，黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷的Rf值分別為：0.50、0.41、0.52，樣品相對(duì)應(yīng)的峰a、b的Rf分別為0.45、0.55，由此可知峰a對(duì)應(yīng)大豆苷，峰b則對(duì)應(yīng)黃豆黃苷和染料木苷.對(duì)此展開(kāi)區(qū)間內(nèi)各峰進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得圖2.由圖2可知，樣品峰b與染料木苷相對(duì)應(yīng)，樣品中無(wú)峰與黃豆黃苷峰圖吻合.綜上所述，樣品中檢測(cè)到大豆苷與染料木苷，未檢測(cè)到黃豆黃苷.

圖2 黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、樣品全波長(zhǎng)掃描圖

圖3 黃豆黃素、大豆苷元、染料木素、樣品3D掃描圖 a：樣品中展開(kāi)距與大豆苷元對(duì)應(yīng)峰，b：樣品中與黃豆黃素、染料木素對(duì)應(yīng)峰.

圖3可知，黃豆黃素、大豆苷元、染料木素的Rf值分別為：0.52、0.31、0.50，樣品相對(duì)應(yīng)的峰a、b的Rf分別為0.35、0.52，由此可知峰a對(duì)應(yīng)大豆苷元，峰b則對(duì)應(yīng)黃豆黃素和染料木素.對(duì)此展開(kāi)區(qū)間內(nèi)各峰進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得圖4.由圖4可知，樣品峰b與染料木素相對(duì)應(yīng)，樣品中無(wú)峰與黃豆黃素峰圖吻合.綜上所述，樣品中檢測(cè)到大豆苷元與染料木素，未檢測(cè)到黃豆黃素.

圖4 黃豆黃素、大豆苷元、染料木素、樣品全波長(zhǎng)掃描圖

2.2樣品中六種大豆異黃酮含量分析對(duì)硅膠板進(jìn)行薄層層析掃描，得到大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，各標(biāo)準(zhǔn)品在試驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R值均大于0.999，RSD值均小于2%.表1可知，大豆乳清水一級(jí)浮渣中黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元、染料木素的含量分別為0、126.75 mg/100 g、48 mg/100 g、0、96.47 mg/100 g、179.34 mg/100 g.大豆乳清水一級(jí)浮渣中大豆異黃酮總量為450.56 mg/100 g.

表1 六種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及其在樣品中含量

2.3精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率測(cè)定結(jié)果表2可知，精密度試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品峰面積值的RSD值均小于2%，說(shuō)明儀器精密度良好；對(duì)樣品的5次平行測(cè)定的峰面積值的RSD值均小于2%，說(shuō)明樣品的重復(fù)性良好.穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)定的峰面積在0～12 h保持穩(wěn)定.

表2 大豆乳清水一級(jí)浮渣中大豆異黃酮的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

表3 大豆乳清水一級(jí)浮渣中大豆異黃酮薄層層析回收率

由表3可知，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的平均加樣回收率分別為99.32%、98.75%、100.19%、98.80%.

2.3討 論大豆異黃酮的提取大多以豆粕為原料，提取時(shí)一般需要先進(jìn)行脫脂，蔡立[1]鞠興榮[2]采用石油醚脫脂，江英[3]用乙醚脫脂，三者最后均用乙醇提取.蔡立[1]又進(jìn)而采用大孔樹(shù)脂吸附-洗脫純化.三者均采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè).

李文亮[4]以豆粕為原料，高榮海[5]和權(quán)靜[6]以脫脂豆粕為原料先進(jìn)行乙醇提取，HCl調(diào)等電點(diǎn)去雜，相繼進(jìn)行大孔樹(shù)脂吸附[4，5]，乙酸乙酯提取[1，5].袁建[7]則先進(jìn)行等電點(diǎn)除雜(HCl沉淀)，后又大孔樹(shù)脂吸附-洗脫制備大豆異黃酮.胡衛(wèi)新[8]以豆粕為原料，用乙醇提取后再進(jìn)行鹽析，等電點(diǎn)沉淀，離心除雜，幾位研究人員都采用HPLC檢測(cè).權(quán)靜[6]還進(jìn)行了薄層層析掃描檢測(cè).

謝明杰[9]等以脫脂豆粕為原料，乙醇作為溶劑超聲提取大豆異黃酮，并采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè).郭睿[10]以大豆和豆芽為原料用石油醚和正己烷脫脂，然后乙醇提取，采用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)大豆異黃酮含量.

亦有文獻(xiàn)報(bào)道微波提取、CO2超臨界提取和高壓高溫電解槽提取等大豆異黃酮提取方法，但文中上述方法囊括了目前實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)上的主要提取和檢測(cè)方法.

綜上所述，目前制備大豆異黃酮的原料主要是豆粕和脫脂豆粕，以大豆和豆芽為原料者少，尚未見(jiàn)以大豆乳清水一級(jí)浮渣為原料提取大豆異黃酮的相關(guān)報(bào)道.提取大豆異黃酮過(guò)程中主要脫脂溶劑為石油醚、正己烷和乙醚等.乙醇是主要的提取溶劑，HCl處理、等電點(diǎn)沉淀及鹽析等是主要的除雜方法，大孔樹(shù)脂吸附是進(jìn)一步精制的主要手段.而檢測(cè)方法主要為紫外分光光度計(jì)法和HPLC法，TLC掃描法者極少.

上述提取大豆異黃酮的原料除含有大豆異黃酮外還有其他的黃酮成分，由于黃酮的黃色、相近的吸收波長(zhǎng)范圍，采用以上樣品處理方法后進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，結(jié)果有一定偏差.HPLC法檢測(cè)需要良好的樣品前處理，否則會(huì)堵塞HPLC分離柱.薄層層析掃描方法可有效解決分光光度計(jì)法及HPLC法檢測(cè)所面臨的上述問(wèn)題.

由表4可知，每位作者TLC檢測(cè)目標(biāo)物不同，分別為愈鳳寧心片[11]、葛根[19]、醬油[17]、大豆廢料[12]、大豆異黃酮酶解物[14]、納豆菌葡萄糖苷酶大豆異黃酮酶解物[13]、蒲公英[21]、槐角和槐角丸[15]、大醬[20]、培根膠囊[18]、染料木素，大豆黃酮[22]和油菜餅[16].每種原料所含成分各不相同，而每種成分均可影響薄層展開(kāi)分離的效果，因此原料決定了展開(kāi)劑的使用.表中每位作者TLC檢測(cè)的目的物種類(lèi)、數(shù)目亦不相同，有的只檢測(cè)一種大豆異黃酮[11～13]，有的檢測(cè)兩種[6，14～16]，有的三種[17，18]，有的檢測(cè)4種[19，20]，有的檢測(cè)的是總黃酮(而非僅僅是異黃酮)[21].在薄層層析檢測(cè)中，就同一種原料來(lái)講，顯示一種目的物的斑點(diǎn)和顯示兩種目的物的斑點(diǎn)所用的展開(kāi)劑亦不相同.因此，所檢測(cè)目的物的種類(lèi)和數(shù)目的差異決定了展開(kāi)劑的差異.

表中所述TLC檢測(cè)大多只是定性檢測(cè)[12～14，16～18，22]，進(jìn)一步的定量分析多采用HPLC法[12～14，18，22]和紫外分光光度計(jì)法[17，12]，而未進(jìn)一步進(jìn)行TLC掃描定量.雖然這可能與當(dāng)時(shí)檢測(cè)條件有關(guān)，但絕不是一個(gè)完備的薄層層析定量方法，表中掃描定量的方法缺乏技術(shù)的完整性.有的未進(jìn)行精密度和回收率的檢測(cè)[21]，有的未進(jìn)行精密度、回收率和穩(wěn)定性檢測(cè)[15]，這不得不引起人們對(duì)方法可靠性的思考.表中方法較為完整的是權(quán)靜的掃描定量方法，但只測(cè)了兩種大豆異黃酮，不適用于本實(shí)驗(yàn)中6種大豆異黃酮的檢測(cè).因此，大豆乳清水一級(jí)浮渣粉中6種大豆異黃酮成分的TLC檢測(cè)必須建立相對(duì)應(yīng)的、新的、準(zhǔn)確的方法.

3 結(jié) 論

本文通過(guò)對(duì)大豆乳清水一級(jí)浮渣樣品前處理，建立了檢測(cè)大豆異黃酮成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，變異在2%之內(nèi).薄層板樣品斑點(diǎn)各自分離清晰，大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)和樣品中相同成分斑點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)，Rf值相近或相同，黃豆黃苷Rf=0.50，大豆苷Rf=0.41，染料木苷Rf=0.52，黃豆黃素Rf=0.52，大豆苷元Rf=0.31，染料木素Rf=0.50，表明了大豆異黃酮各成分展開(kāi)、分離良好.進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性(在0～12 h穩(wěn)定)和回收率(98.75%～100.19%)檢測(cè)，可以肯定地說(shuō)該方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定，是適合大豆乳清水一級(jí)浮渣及其大豆異黃酮產(chǎn)品檢測(cè)的一個(gè)完整、快速、省時(shí)、實(shí)用的新方法.

表4 大豆異黃酮薄層層析研究文獻(xiàn)總結(jié)