趙海平，張國(guó)坤，姚夢(mèng)杰，李春義，2*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所/吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.長(zhǎng)春科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022

鹿茸是梅花鹿CervusnipportTemminck或馬鹿CervuselaphusLinnaeus雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，作為珍貴的中藥材，也用來作為保健品的原料，具強(qiáng)筋健骨、壯腎陽、益精血等作用[2]，其多種藥用和保健功能得到了廣泛認(rèn)可。《中華人民共和國(guó)藥典》將鹿茸的功能與主治敘述為：壯腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨，調(diào)沖任，托瘡毒。我國(guó)市場(chǎng)上的鹿茸藥材約有80%產(chǎn)于梅花鹿[3]。梅花鹿鹿茸的道地產(chǎn)區(qū)一直是一個(gè)懸而未決的問題。梅花鹿養(yǎng)殖主要集中在東北地區(qū)[4]，因此業(yè)內(nèi)人士一般認(rèn)為，東三省是梅花鹿鹿茸的最佳產(chǎn)區(qū)。

道地性是藥材在特定環(huán)境中形成的綜合性特征，每種道地藥材都具其獨(dú)特的生態(tài)地理環(huán)境[5]，因此探索不同產(chǎn)地藥材所含成分的差異成為建立藥材道地產(chǎn)區(qū)檢測(cè)方法的有效手段之一，如結(jié)合相關(guān)的有機(jī)成分與微量元素來研究藥材的道地性[6]。

鹿茸中含有豐富的有機(jī)物質(zhì)、礦物質(zhì)和微量元素[7-14]。研究證明，不同產(chǎn)地鹿茸中次黃嘌呤[15]、蛋白多肽[16]、核苷類[17]等有機(jī)成分均有一定的差異。然而，目前尚未見關(guān)于不同產(chǎn)地鹿茸所含礦物質(zhì)元素的對(duì)比研究。本研究采集了梅花鹿鹿茸主產(chǎn)區(qū)吉林省和非主產(chǎn)區(qū)山東省共7個(gè)地區(qū)鹿茸為研究對(duì)象，采用微波消解法處理樣品，運(yùn)用微波消解-電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)分析技術(shù)隨機(jī)測(cè)定了鹿茸中18種礦物質(zhì)元素的含量，以期為研究不同產(chǎn)區(qū)鹿茸的道地性提供參考。

1 儀器與試劑

密閉微波消解儀(型號(hào)：MARS5，美國(guó)CEM公司)；電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS，型號(hào)：7700X，美國(guó)安捷倫公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：DHG-9013A，上海一恒儀器有限公司)；凍干機(jī)(型號(hào)：FDU-1100，東京理化公司EYELA系列)。

元素標(biāo)準(zhǔn)溶液包含Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1)；濃硝酸(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；30%過氧化氫(南京化學(xué)試劑股份有限公司)。

2016年7—8月在吉林省和山東省大型梅花鹿養(yǎng)殖場(chǎng)采取鹿茸42份，詳見表1；采樣方式：自二杠茸或三杈茸基部鋸取厚度為1 cm的鹿茸片。經(jīng)由依托于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所的吉林省鹿茸工程技術(shù)研究中心鑒定為梅花鹿CervusnipponTemminck鹿茸。

表1 吉林省和山東省鹿茸樣品來源信息

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：元素(Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au)標(biāo)準(zhǔn)溶液的原始質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1，使用前稀釋至所需濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制Na、Mg、P、K、Ca混合標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10 mg·L-1。Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au、Cd、Ag混合標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為0、5、10、20、50、100 μg·L-1。內(nèi)標(biāo)溶液選取一定體積的元素母液，用2%硝酸將其稀釋至10 μg·L-1。在選定的濃度范圍內(nèi)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，r均大于0.999 0，見表2，表明上述元素在0.3～100 μg·L-1線性關(guān)系良好。

表2 元素線性方程

2.2 鹿茸樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取制備好的鹿茸樣品0.5 g于消解罐中，加入4.0 mL濃硝酸、1.0 mL 30%過氧化氫，混勻，蓋好內(nèi)外蓋，置于微波消解系統(tǒng)內(nèi)消解，消解條件見表3。消解完畢后冷卻至室溫，取出消解罐，將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，搖勻后待測(cè)。ICP-MS儀器工作條件：霧化室溫度2 ℃，等離子流14 L·min-1，蠕動(dòng)泵速度25 r·min-1，等離子射頻功率1550 W，輔助氣體積流量0.79 L·min-1，霧化器體積流量1.0 L·min-1，KED測(cè)定模式。根據(jù)儀器靈敏信號(hào)進(jìn)行對(duì)不同元素的同位素篩選之后，確定該檢測(cè)方法中各元素的質(zhì)量數(shù)，見表4。

表3 微波消解條件

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢測(cè)限 連續(xù)測(cè)定空白溶液11次，以測(cè)定元素信號(hào)響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍所對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限，結(jié)果見表2，各元素的檢測(cè)限多處于10-12級(jí)別，方法靈敏度高。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取18種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液各自連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定含量，18種元素的RSD為1.90%～2.70%，見表2，表明儀器的精密性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)取鹿茸樣品CC1 號(hào)6份，按2.2項(xiàng)方法制成待測(cè)溶液。測(cè)試研究涉及到的18種元素的RSD為1.80%～4.52%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取鹿茸樣品CC1號(hào)，按2.2項(xiàng)方法制成待測(cè)溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h上樣，18種元素的RSD為1.21%～4.02%，表明樣品在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已經(jīng)測(cè)定的樣品CC1 0.5 g(5份)，精密稱量，精準(zhǔn)加入一定量的各元素的對(duì)照品溶液，按照相同條件測(cè)試，計(jì)算各元素的回收率為96.90%～102.80%，RSD均在5%以下。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地鹿茸中18種礦物質(zhì)元素含量及產(chǎn)地之間差異性分析

采用2.1和2.2描述的方法檢測(cè)不同產(chǎn)地42份樣品元素含量，結(jié)果見表5。從地區(qū)角度分析，Cr在各個(gè)地區(qū)鹿茸樣品中含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他元素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，如：Co含量四平地區(qū)的極顯著低于長(zhǎng)春和吉林地區(qū)，Cd含量四平、長(zhǎng)春和吉林3個(gè)地區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從省份角度分析，山東省4個(gè)產(chǎn)區(qū)鹿茸P和Ca含量高于吉林省3個(gè)產(chǎn)地，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；元素Mg和Zn含量吉林地區(qū)鹿茸極顯著低于山東地區(qū)鹿茸；除臨沂樣品外，鹿茸元素K含量在吉林產(chǎn)區(qū)極顯著高于山東其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)。Au在各個(gè)產(chǎn)地的大部分樣品中均未檢出。礦物質(zhì)元素Ca和P在鹿茸中含量豐富，Ca和P含量比例接近2∶1。

表4 重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

注：Na、Mg、Al、P、K、Ca含量單位是mg·kg-1；Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au、Cd、Ag含量單位是μg·kg-1，下同；—表示無數(shù)據(jù)。

表5 不同產(chǎn)地鹿茸中18種礦物質(zhì)元素含量

注：上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)字母表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.2 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析被廣泛應(yīng)用到中藥材元素含量及其他營(yíng)養(yǎng)成分分析中，通過對(duì)多個(gè)具備相關(guān)性的指標(biāo)進(jìn)行分析，從而衡量不同組分之間的聯(lián)系。本研究對(duì)鹿茸樣品中18種元素進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果見表6。從表6可以看出，某些元素成分之間存在顯著或者極顯著相關(guān)性。Na與Mg、P、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Se、Pb、Ba含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Mg與P、K、Ca、Cu、Zn、Se、Ba含量極顯著相關(guān)；P與K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se，Cd、Ba含量極顯著相關(guān)；K和Ca、Cu，Zn、Se、Pb、Ba含量極顯著相關(guān)；Ca與Fe、Cu、Zn、Se、Cd、Ba含量極顯著相關(guān)；Mn與Zn、Pb、Ba含量極顯著相關(guān)；Fe與Co、Cu、Cr、As、Cd含量極顯著相關(guān)；Co與Cr、As含量極顯著相關(guān)；Cu與Se、As、Cd含量極顯著相關(guān)；Zn含量與Pb、Ba含量極顯著相關(guān)。

3.3 主成分分析

通過SPSS軟件對(duì)所有樣品進(jìn)行主成分分析，明確18種元素在吉林省和山東省不同產(chǎn)地鹿茸礦物質(zhì)元素變異中各自的貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表7。從表7可以看出，前2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到91.88%，能夠闡明要說明的大多數(shù)變異信息。其中，第1個(gè)主成分(PC1)累計(jì)貢獻(xiàn)率為70.32%，主要反映的是來自Na、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、As、Cd、Ag、Pb、Ba的信息。第2主成分(PC2)累積貢獻(xiàn)率為21.56%，主要反映的是來自Mg、Cr、Ag、Ba的信息。

表6 鹿茸中18種礦物質(zhì)元素皮爾遜相關(guān)性分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

表7 主成分載荷表

4 討論

東三省的氣候條件適合于梅花鹿的養(yǎng)殖，也是我國(guó)鹿茸的主要供應(yīng)區(qū)，最有可能成為梅花鹿的道地產(chǎn)區(qū)。吉林省是我國(guó)梅花鹿茸產(chǎn)量最大的省份[18]。山東省雖然不是我國(guó)梅花鹿茸的主產(chǎn)區(qū)，但也是除東三省外產(chǎn)量最大的省份之一。本研究首次對(duì)梅花鹿茸主產(chǎn)區(qū)和非主產(chǎn)區(qū)的礦物質(zhì)元素的含量進(jìn)行比較分析，為研究鹿茸的道地性提供了理論和數(shù)據(jù)支持。

道地性是評(píng)價(jià)中藥品質(zhì)優(yōu)劣的傳統(tǒng)理論和方法，是中醫(yī)藥學(xué)經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)總結(jié)，也是中醫(yī)理論在長(zhǎng)久實(shí)踐過程中提煉出來的對(duì)中藥質(zhì)量控制的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此道地性作為中醫(yī)藥領(lǐng)域獨(dú)特的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，其理念深深地根植于中醫(yī)理論體系中[20]。道地藥材存在化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)特性[21]，具體表現(xiàn)為活性成分的含量差異。礦物元素自身不能合成，必須從環(huán)境中攝取，因此不同產(chǎn)地產(chǎn)品有各自的礦物質(zhì)特征[22-23]。此外，產(chǎn)品的貯藏時(shí)間和貯藏條件對(duì)其礦物元素含量影響較小[24-25]。因此，相對(duì)于有機(jī)物，礦物質(zhì)元素更適合用于研究藥材的道地性。雖然不同產(chǎn)地鹿茸中次黃嘌呤[15]、白多肽[16]、核苷類[17]等有機(jī)成分均有一定程度的差異，但是上述研究中并沒有找到與鹿茸道地性單一相關(guān)的因素。

不同產(chǎn)地來源鹿茸礦物質(zhì)元素差異分析結(jié)果表明，有幾種元素含量因產(chǎn)地不同而存在差異，如：Co含量四平地區(qū)極顯著低于長(zhǎng)春和吉林地區(qū)；Cd含量四平、長(zhǎng)春和吉林三個(gè)地區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；山東省4個(gè)產(chǎn)區(qū)鹿茸P和Ca含量高于吉林省3個(gè)產(chǎn)地，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；元素Mg和Zn含量吉林地區(qū)鹿茸極顯著低于山東地區(qū)鹿茸；除臨沂樣品外，鹿茸元素K含量在吉林產(chǎn)區(qū)極顯著高于山東其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)等。因此，以某種或某些元素為指標(biāo)，可以在一定程度上將不同產(chǎn)地的鹿茸進(jìn)行區(qū)分。由于某些種類礦物質(zhì)元素在鹿茸不同區(qū)段含量不同。因此，在通過礦物質(zhì)元素研究鹿茸道地性時(shí)，需要排除鹿茸不同區(qū)段礦物質(zhì)含量的影響。孫偉麗等[26]通過對(duì)梅花鹿三杈茸不同加工方式及不同區(qū)段20種礦物質(zhì)元素含量的分析發(fā)現(xiàn)，Na、Mg、Al、P、K和Ca在不同區(qū)段之間含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Al、P、Ca、Na、Mg和K含量在煮炸茸和凍干茸兩種加工方式之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究所采集的樣品來自于鹿茸二杠或三杈的基部，在此部位Zn的含量不存在不同區(qū)段和加工方式的差異[26]。主成分分析顯示，前2個(gè)主成分PC1和PC2的累積貢獻(xiàn)率為91.88%，能夠解釋大部分變異，Zn位于第一類主成分中。因此，Zn含量可以作為單一相關(guān)的候選因素，研究鹿茸的道地性。相關(guān)分析顯示：Zn含量與Pb、Ba含量極顯著相關(guān)，說明Pb和Ba含量可以作為輔助指標(biāo)。

重金屬元素在人體中蓄積到一定量會(huì)引發(fā)中毒癥狀，因?yàn)橹亟饘僭赝沟鞍踪|(zhì)變性，影響組織細(xì)胞的生理功能，進(jìn)而影響肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等功能。重金屬元素一直是衡量中藥材品質(zhì)的關(guān)鍵因素[27]，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版限定了中藥材重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)為Pb≤5.0 mg·kg-1、Cd≤0.3 mg·kg-1、Cu≤20 mg·kg-1、As≤2.0 mg·kg-1。鹿茸作為動(dòng)物性來源中藥材也可能會(huì)因?yàn)閯?dòng)物攝入草食飼料、飲水等因素帶來重金屬超標(biāo)問題。本研究通過《中華人民共和國(guó)藥典》2015版的ICP-MS法，測(cè)定的7個(gè)產(chǎn)地來源的42份鹿茸樣本重金屬Pb、Cd、Cu和As均無超標(biāo)，符合我國(guó)中藥材重金屬的安全性規(guī)定，因此可以放心食用。