王芳，范雨，葉茂，曹秀君，童芯鋅，彭成，國錦琳

成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

阿膠(Asini Corii Colla)為馬科動(dòng)物驢EquusasinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮和濃縮制成的固體膠，具有優(yōu)良的滋補(bǔ)作用?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)明確規(guī)定生產(chǎn)阿膠的原料是驢皮[1]。由于阿膠在市場上經(jīng)常供不應(yīng)求，以其他動(dòng)物皮加工成偽阿膠的現(xiàn)象層出不窮，主要以廉價(jià)的豬皮、牛皮作為皮源，甚至用重金屬超標(biāo)的廢舊皮革制成的明膠摻假，服用后有明顯不良反應(yīng)，因此亟需建立阿膠質(zhì)量控制方法。

不同皮源膠原蛋白同源性高，氨基酸組成及含量極為相近，具有相似的化學(xué)性質(zhì)，常用方法如：氨基酸組分含量分析、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)法及色譜法等均缺乏專屬性、針對性，難以對不同皮源膠原蛋白進(jìn)行有效鑒別[2]。阿膠在加工過程中脫氧核糖核酸(DNA)降解破壞嚴(yán)重，因此DNA分子鑒定方法難以有效鑒別阿膠[3]。近年來，雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)識(shí)別特征多肽逐漸成為膠類中藥材鑒定的主流方法[2]。Aina等[4]采用2-DE技術(shù)初步檢測出10個(gè)豬皮膠特異蛋白斑點(diǎn)，2-DE技術(shù)對蛋白制備要求高，條件考察繁瑣。而LC-MS技術(shù)由于其快速、精準(zhǔn)及全面分離分析的特點(diǎn)，已廣泛用于蛋白組學(xué)研究，成為對多肽組分、結(jié)構(gòu)及殘基修飾進(jìn)行分析的主流技術(shù)[5]。2009年，Zhang等[6]利用胰酶酶解豬和牛明膠，通過LC-MS檢測出可區(qū)分豬和牛明膠的特征肽并給出氨基酸序列，建立了LC-MS技術(shù)識(shí)別特征肽鑒別豬牛明膠的新方法。2012年，Cheng等[7]通過超高壓液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-QTOF)首次系統(tǒng)性檢測5種皮膠原(驢皮膠、豬皮膠、牛皮膠、龜殼膠及鹿角膠)特征肽對5類皮膠原進(jìn)行專屬性鑒別，但比對特征肽序列發(fā)現(xiàn)牛皮膠特征肽序列與驢皮膠并無差異，可能是樣品前處理導(dǎo)致結(jié)果不太理想?！吨袊幍洹分胁捎肔C-MS法，以質(zhì)荷比(m/z)539.8離子對阿膠進(jìn)行鑒定，但未給特征肽序列[1]，特異性不能最終確定，但仍能表明LC-MS技術(shù)已用于建立膠類藥材質(zhì)量控制規(guī)范。2015年，Chen等[8]采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法建立了特異快速檢測中成藥鹿角膠中摻偽驢皮和牛皮成分專屬性特征離子峰方法，但未確定特征肽序列。綜上所述，當(dāng)前鑒定方法存在一些共有的局限：1)皮膠原成分復(fù)雜，除了主要成分膠原蛋白外，還含有血清蛋白、毛發(fā)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)干擾以膠原蛋白為對象的鑒定方法，另外，膠原蛋白分子量大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及難溶等特點(diǎn)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性，但此環(huán)節(jié)常被忽略；2)基于酶解后基質(zhì)的復(fù)雜性，直接從總離子流圖(TIC)中尋找特征性肽段，針對性不強(qiáng)，效率不高；3)找出了特征離子，還需進(jìn)一步的鑒定特征肽序列以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，繁瑣耗時(shí)。

因此，本研究首次通過生物信息技術(shù)模擬酶解過程以全面準(zhǔn)確地預(yù)測驢皮、豬皮及牛皮的特征肽并獲得相應(yīng)的序列及分子量信息，對樣品前處理和酶解條件進(jìn)行全面考察優(yōu)化，獲得穩(wěn)定、大量、連續(xù)的小分子肽段，采用UPLC/Q-TOF-MS進(jìn)行高效分離分析，驗(yàn)證理論篩選出的特征肽段，從而建立穩(wěn)定、靈敏、可量化及專屬性高的阿膠鑒定和質(zhì)量控制方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 隨機(jī)收集不同企業(yè)不同批號(hào)的阿膠以及不同市場銷售的驢皮、牛皮和豬皮樣品，樣品信息見表1，均經(jīng)過成都中醫(yī)藥大學(xué)國錦琳教授鑒定，留樣保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 樣品信息

1.1.2 試劑 牛血清蛋白(BSA)、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris堿、N，N′-甲叉丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購自Bio-Rad公司；考馬斯亮藍(lán)R-250與G-250、過硫酸銨(APS)、β-巰基乙醇和溴酚藍(lán)指示劑均購自鵬程生物科技有限公司；極低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker購自北京Solarbio；胰蛋白酶Trypsin 1：250(CAS：9002-07-7，Amersco)。

乙腈、甲醇為色譜純，均購自Thermofisher公司；碳酸氫銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸、三氯甲烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙醇、丙酮、冰乙酸、甲酸、丙三醇和三氯乙酸均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.1.3 儀器 肽柱-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent)；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀(日立高新技術(shù)公司)；UMAX PowerLook 2100XL凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；MINI-PROTEAN 165-8000小型垂直電泳儀(Bio-Rad)；DHG-9035A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海島韓實(shí)業(yè)公司)；BP211D 型十萬分之一分析天平(德國Sartorius)；UV-1800 PC型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；Agilent 1200SL-6210A高效液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent)；DP-D501普通型冷凍干燥機(jī)(無錫德普儀器制造有限公司)。KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FE-20K型pH計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；Allegra TM X-22R型低溫高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter)。

1.2 生物信息技術(shù)模擬酶解

通過查詢National Center for Biotechnology Information蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(NCBI)，采用生物信息學(xué)軟件ExPaSy PeptideCutter模擬酶解尋找酶切位點(diǎn)，比對驢皮、牛皮和豬皮的I型膠原蛋白α1鏈氨基酸序列，找出其差異。再利用軟件ExPASy PeptideMass模擬胰酶酶解結(jié)果，篩查驢皮特異性肽段[9]。

1.3 樣品處理

所有皮部樣品均按照《中國藥典》方法進(jìn)行處理，具體做法是：先取一定量的樣品，浸泡于水中并除毛切塊，再次洗凈后水煮過濾，將過濾液濃縮至濃稠糊狀，最后冷卻使其凝固，切成片并干燥，制成堅(jiān)固的膠狀，打粉過六號(hào)藥典篩后4 ℃保存。

本研究摸索超聲法、加熱法及碾磨法對樣品進(jìn)行溶解處理。稱取1 g樣品粉末，加入40 mL 1% NH4HCO3溶液置于50 mL錐形瓶中，密封后用超聲處理20 min；密封后放入水浴鍋中以60 ℃加熱30 min溶解后取出樣品溶液；稱取1 g阿膠樣品粉末于研缽中碾磨，加入40 mL1% NH4HCO3溶液研磨至溶解；將3種方法處理后的溶解樣品分別按8000 r·min-1離心20 min，Bradford法[10]測定蛋白含量。采用環(huán)己烷-三氯甲烷和環(huán)己烷-二氯甲烷萃取系統(tǒng)對樣品進(jìn)行處理[11-12]。再通過三氯乙酸-丙酮法、過濾法和超濾法進(jìn)行純化[13]。在參考方法上稍有改動(dòng)：過濾法，將溶解后的樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，置4 ℃保存待用；超濾法，將萃取后的樣品置于10 kDa的超濾管中3000 r·min-1離心30 min后將小分子雜質(zhì)除去。通過SDS-PAGE電泳法對樣品處理效果進(jìn)行評(píng)定，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，上樣量為20 μL，其余蛋白樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生物酶解

將上述蛋白樣品進(jìn)行胰酶酶解(1% NH4HCO3配制成1 mg·mL-1胰酶溶液，酶活250 U·mg-1)。為保證樣品中膠原蛋白被完全酶解為小肽，本研究從酶解的時(shí)間、溫度、酶量、pH值4個(gè)方面進(jìn)行考察條件[9]，設(shè)置如表2所示。

將酶解液放入超濾管中3000 r·min-1離心50 min，收集濾液，三羥甲基甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)進(jìn)行分析[9]。

表2 酶解條件

1.5 UPLC/Q-TOF-MS分析

色譜柱為Agilent肽柱-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；選用0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相A，選用乙腈作為流動(dòng)相B。梯度0～5 min，5%B；5～8 min，5%～10%B；8～32 min，10%～20%B；32～38 min，20%～95%B；38～38.1 min，95%～5%B；流速0.30 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。

氮?dú)饬髁繛?0 L·min-1，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，噴霧壓力為40 Psi，碎裂電壓設(shè)為150 V，霧化氣溫度350 ℃，在正離子模式下檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 I型膠原蛋白模擬酶切的生物信息分析

I型膠原蛋白α1鏈氨基酸序列在NCBI、Swiss-prot上查得，其序列號(hào)為：豬皮Ovisaries(XP_013836466)、驢皮Equusasinus(GI：221665286)、牛皮Bostaurus(GI：77404252)。通過DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行同源比對，上述序列相似性95.56%。可以看出，不同種類的動(dòng)物皮，盡管I型膠原蛋白α1鏈序列非常相似，但是所查到的3種皮類的氨基酸序列存在差異，這為后續(xù)試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。除此之外，序列的比對結(jié)果表明，4種膠原蛋白特異氨基酸(羥脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸)的組成與含量沒有顯著差別，這提示了傳統(tǒng)區(qū)分阿膠的真?zhèn)蔚姆椒ㄊ蔷哂胁蛔阒幍摹?/p>

據(jù)Peptide Cutter生物信息學(xué)軟件模擬酶解過程，顯示出膠原蛋白能被胰酶酶解為相對較多的小分子片段，因此選擇胰酶酶切。然后經(jīng)過軟件系統(tǒng)ExPASy PeptideMass模擬酶切得到的肽段序列，與后續(xù)特異性肽片段互相印證。表3顯示的是通過3種皮類I型膠原蛋白α1鏈模擬酶切結(jié)果，酶解肽段分子量在0.6～2.5 kDa范圍內(nèi)，對比篩選出13個(gè)牛皮、12個(gè)驢皮及12個(gè)豬皮源特異肽段，酶解肽段具有較高的連續(xù)性和匹配度，為質(zhì)譜識(shí)別特征多肽提供基礎(chǔ)，也為后期實(shí)驗(yàn)奠定理論依據(jù)。

表3 生物信息分析篩選的牛皮、驢皮、豬皮I型膠原蛋白α1鏈特征肽段信息

2.2 驢皮及其他皮類總離子流圖的建立

2.2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 阿膠含雜質(zhì)多，主要成分為膠原蛋白，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難溶。本實(shí)驗(yàn)比較了超聲法、加熱法及研磨法溶解樣品，結(jié)果表明：加熱法比超聲法溫和，提取的蛋白量大，蛋白損傷量小。二氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)和超濾法純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳(見圖1)。可以看出，蛋白分子量在180～300 kDa，符合膠原蛋白分子量分布范圍?；谝陨蠑?shù)據(jù)，本研究采用加熱法溶解、二氯甲烷-環(huán)己烷萃取和超濾法對樣品進(jìn)行前處理。

注：A.萃取系統(tǒng)考察；B.純化條件考察；1.三氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)；M.蛋白Marker；2.二氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)；3.過濾法；4.超濾法；5.三氯乙酸-丙酮法。圖1 不同前處理?xiàng)l件阿膠的SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.2 酶解條件優(yōu)化 通過Tricine-SDS-PAGE檢測酶解結(jié)果，優(yōu)化后的酶解條件為：酶解溫度38 ℃，消化時(shí)間12 h以上，pH 8.0，加酶比為4∶1～1∶1，底物質(zhì)量濃度為0.017～0.025 g·mL-1。以上條件下，膠原蛋白被較為充分酶解，酶解肽段多集中在1.2～3.3 kDa，與生物信息預(yù)測結(jié)果基本相符，圖2為底物濃度考察結(jié)果。

注：1.加酶比為1∶1；2.加酶比為2∶1；M.蛋白Marker；3.加酶比為3∶1；4.加酶比為4∶1。圖2 底物濃度考察Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.3 3種皮類UPLC-TOF/MS分析結(jié)果 由圖3可見，3種皮類的多肽總離子流圖較為相似，主要是由于特征性肽段的數(shù)量在膠原蛋白序列中所占比例小。根據(jù)《中國藥典》方法提供的阿膠特征性多肽離子m/z 539.8，對3種皮類的圖譜進(jìn)行提取離子分析。

注：Sample 1.牛皮樣品多肽總離子流圖；Sample 2.豬皮樣品多肽總離子流圖；Sample 3.驢皮樣品多肽總離子流圖。圖3 3種皮類所得多肽的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

經(jīng)驗(yàn)證，m/z539.8對樣品進(jìn)行提取離子分析，能找出3種皮類的差異，酶解驢皮在16.87 min提取離子掃描中有明顯響應(yīng)值。而其他皮類是空白，由此可根據(jù)m/z539.8來鑒定阿膠真?zhèn)?，?jīng)換算，藥典用于鑒定阿膠的特征肽段不包含在生物信息技術(shù)預(yù)測的驢皮特征肽段內(nèi)，推測可能由于樣品前處理及酶解條件差異產(chǎn)生不完全酶解或與肽段上某些氨基酸殘基后期修飾有關(guān)。

將理論計(jì)算出的特異性肽段分子量換算為m/z，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，m/z766.4能找出3種皮類的差異，酶解驢皮在27.76 min提取離子掃描中有明顯響應(yīng)值，表明m/z為766.4，分子量為1 530.802 2可作為鑒別阿膠的特異峰，對應(yīng)的多肽為GEAGPAGPAGPIGPVGAR。

2.3 實(shí)際樣品的鑒定結(jié)果

對于10組收集到的樣品用上述的特異性阿膠鑒別方法能進(jìn)行有效的鑒別。數(shù)據(jù)結(jié)果表明(圖4)，10組阿膠樣品中，僅3、4、10號(hào)阿膠樣品檢測出特征峰，以驢皮膠為對照，測定特征峰相對豐度，結(jié)果顯示這3種阿膠樣品相對豐度分別為67%、38%、72%，因此，這3種阿膠產(chǎn)品基本符合標(biāo)準(zhǔn)，通過特征峰豐度分析可進(jìn)一步量化阿膠產(chǎn)品中驢皮膠含量。第7、9號(hào)樣品也出現(xiàn)特征峰，但相對豐度比例甚小，其余5種阿膠樣品完全檢測不出特征峰，可由此結(jié)果推測阿膠質(zhì)量問題之嚴(yán)重。

注：A.3號(hào)阿膠樣品的提取離子流圖；B.4號(hào)阿膠樣品的提取離子流圖；C.10號(hào)阿膠樣品的提取離子流圖。圖4 酶解阿膠樣品m/z 766.4時(shí)提取離子流圖

3 結(jié)論與展望

驢、牛及豬的膠原蛋白氨基酸序列在NCBI上查得后經(jīng)ExPASy PeptideMass進(jìn)行酶切模擬，得到12段驢皮存在的特異性肽段，可能為特異性鑒別肽段。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，m/z766.4，分子量為1 530.802 2，對應(yīng)的多肽為GEAGPAGPAGPIGPVGAR能有效鑒別驢皮與其他皮類。在10組阿膠樣品中，據(jù)此肽段進(jìn)行鑒定的結(jié)果表明該方法與《中國藥典》方法的鑒定能力一致。本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用生物信息技術(shù)模擬、對比和篩選3種皮類胰酶酶解的差異性肽段，并提供肽段的氨基酸序列、位置及分子量。與已報(bào)道的特征肽段檢測方法相比，本研究采用生物信息技術(shù)結(jié)合HPLC-MS方法，通過理論實(shí)驗(yàn)相互印證使結(jié)果更加全面、穩(wěn)定、高效。另外，本研究首次對樣品前處理方法進(jìn)行系統(tǒng)考察，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、高效奠定基礎(chǔ)。本研究基于生物信息技術(shù)結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，檢測到1條與預(yù)測結(jié)果匹配的驢皮膠特異肽，下一步將建立阿膠特異肽數(shù)據(jù)庫，促進(jìn)膠類藥材質(zhì)量控制方法的系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。