成小蘭，龐中化，王志剛，胡春萍，呂章明，曹鵬

江蘇省中醫(yī)藥研究院/南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物，主產(chǎn)于河北、山東、四川等地。蟾酥味甘、辛，性溫，有毒，具有開(kāi)竅醒神、解毒、止痛等功效，主治惡瘡、瘰疬、癌腫、咽喉腫痛、牙痛等局部結(jié)腫及其引發(fā)的疼痛[1]。近年被用于治療急性心力衰竭、慢性支氣管炎、坐骨神經(jīng)痛等[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蟾酥具有抗腫瘤、強(qiáng)心、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種作用[3]。最新研究顯示，蟾酥可增強(qiáng)去甲腎上腺素所引起的大鼠輸精管的收縮，并呈劑量依賴性收縮反應(yīng)。此外，蟾酥還具有鎮(zhèn)咳、利尿、興奮腸道平滑肌以及促進(jìn)糖元抑制乳酸生成的胰島素樣作用[4]。蟾酥含有大量蟾蜍毒素類物質(zhì)，尚含有酯蟾毒配基-3-單辛二酸脂、蟾毒靈-3-單辛二酸酯、華蟾毒精-3-單辛二酸酯、膽固醇、吲哚系堿類等成分，其中蟾蜍毒素類成分是蟾酥的主要有效成分[5-7]。蟾酥是臨床常用的名貴動(dòng)物藥之一，應(yīng)用廣泛，療效確切。眾多成方制劑如六神丸、麝香保心丸、蟾酥注射液等均含有該藥材。由于蟾蜍基原動(dòng)物的多樣化，加之中藥大品種的技術(shù)升級(jí)以及蟾酥資源需求量的增加，蟾酥價(jià)格不斷高漲，不法商販在蟾酥中摻假以謀取暴利，導(dǎo)致市場(chǎng)商品蟾酥品種混雜、摻雜、摻假現(xiàn)象嚴(yán)重，常見(jiàn)摻偽品主要包括：淀粉、泥沙、蛋白、松香粉、牙膏、肥皂、豬油等雜質(zhì)[8]。混偽品導(dǎo)致蟾酥質(zhì)量差異較大，不能保證用藥的有效性和安全性。因此建立有效可靠的蟾酥藥材鑒定方法，用于嚴(yán)格控制蟾酥藥材及飲片的質(zhì)量顯得尤為重要。

蟾酥常用的傳統(tǒng)真?zhèn)舞b別方法包括外觀形狀鑒別和理化鑒別。但由于蟾酥經(jīng)過(guò)初加工后，缺乏基原動(dòng)物的外觀形態(tài)，傳統(tǒng)鑒別法存在一定的局限性。近年來(lái)，隨著DNA分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，基于COI基因條形碼技術(shù)的藥材分子鑒定為動(dòng)物藥材的鑒別提供了全新而有效的輔助手段[9]。但由于蟾蜍是兩棲類動(dòng)物，且該兩棲類物種基因組受環(huán)境影響較大，基因組存在較大的變異性，單純依靠COI測(cè)序難以對(duì)蟾蜍進(jìn)行鑒定。此外，在蟾酥加工過(guò)程中，DNA受到較大破壞，因此難以從蟾酥中提取線粒體DNA，更增加了通過(guò)條形碼鑒定混偽品的難度。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、整體的鑒定手段，可較全面地反映藥材/飲片的化學(xué)成分以及特征峰面積的相對(duì)比例。在對(duì)藥材/飲片指紋圖譜分析的基礎(chǔ)上，采用不同的統(tǒng)計(jì)處理方法進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別，可在藥材/飲片質(zhì)量、產(chǎn)地、種屬、真?zhèn)蔚呐袆e中克服人工鑒定的主觀因素，從而更加準(zhǔn)確地對(duì)藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)，應(yīng)用廣泛[10-11]。本研究采用HPLC梯度洗脫法構(gòu)建不同產(chǎn)地蟾酥藥材指紋圖譜，并對(duì)10批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)、聚類分析和主成分分析，旨在為蟾酥的質(zhì)量控制和鑒別研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，Waters2996型二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站(美國(guó)Waters公司)，METTLER AB204-S萬(wàn)分之一電子天平，METTLER AG285十萬(wàn)分之一電子天平，Milli-Q純水器(美國(guó)Millipore公司)

1.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.3 對(duì)照品

蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對(duì)照品由江蘇省中醫(yī)藥研究院化學(xué)研究室提供，純度>98%。

1.4 實(shí)驗(yàn)樣品采集及鑒定

本研究所用蟾酥樣品詳見(jiàn)表1。所有樣品均由江蘇省中藥研究院中藥資源實(shí)驗(yàn)室錢(qián)士輝研究員鑒定。

表1 蟾酥樣品信息

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

利用高效液相色譜法，采用Waters MS C18色譜柱(250 mm×4.6mm，5 μm)；流動(dòng)相：純水和0.1% TFA乙腈溶液(梯度洗脫)；檢測(cè)波長(zhǎng)：296 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積30 μL。

表2 純水(A)-0.1% TFA乙腈(B)梯度洗脫

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對(duì)照品適量，分別用甲醇溶解得對(duì)照品溶液。精密吸取各對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取蟾酥細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇稱質(zhì)量，加熱回流提取1 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，靜置，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 精密度試驗(yàn) 取蟾酥供試品溶液(S1)，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，采用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》分析，以蟾毒靈為參照物，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.096 0%～0.156 9%，相對(duì)峰面積RSD為0.840 6%～3.349 3%，均小于5%，符合指紋圖譜檢測(cè)要求。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蟾酥供試品溶液(S1)分別在0、2、4、12、24 h進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以蟾毒靈為參照物，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.263 6%～0.521 2%，相對(duì)峰面積RSD為2.414 0%～3.666 3%，表明供試液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份蟾酥樣品(S1)6份，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，采用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》分析，以蟾毒靈為參照物，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.063 9%～0.439 0%，相對(duì)峰面積RSD為0.659 2%～4.952 0%，表明重復(fù)性良好。

3.2 不同產(chǎn)地蟾酥指紋圖譜的建立與分析

3.2.1 HPLC指紋圖譜測(cè)定 取不同產(chǎn)地10批蟾酥樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蟾酥HPLC特征圖(S1～S10)

3.2.2 對(duì)照指紋圖譜的建立和共有峰的標(biāo)定 將3.2.1條件下測(cè)定的色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，以S1樣品為參考圖譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 s，中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜(圖2)。蟾酥色譜指紋圖譜以保留時(shí)間為44.079 6 min的9號(hào)峰作為參照峰S，對(duì)不同蟾酥藥材的指紋圖譜進(jìn)行考察，共確定了10個(gè)共有峰，各共有峰面積見(jiàn)表3。

圖2 蟾酥對(duì)照指紋圖譜

表3 不同產(chǎn)地10批蟾酥藥材共有峰面積

3.2.3 指紋圖譜分析 由圖1可知，蟾酥化學(xué)成分復(fù)雜，不同產(chǎn)地蟾酥化學(xué)組成基本相似，但含量差別較大，其共有峰面積RSD為4.22%～17.31%，在10 批次樣品圖中9號(hào)色譜峰(蟾毒靈)的分離度良好，所有樣品共有且為蟾酥主要成分之一，因此將其確定為參照峰S。

3.2.4 相似度評(píng)價(jià) 使用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2012版)》對(duì)10批蟾酥藥材色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以S1樣品色譜圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用“中位數(shù)”法生成對(duì)照?qǐng)D譜，得到10批蟾酥藥材特征圖譜及相似度。結(jié)果10批不同產(chǎn)地蟾酥藥材各色譜圖相似度在0.920～0.967，表明10批藥材相似度較好。

表4 不同產(chǎn)地蟾酥HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

3.3 主成分分析

以蟾酥指紋圖譜中標(biāo)定的共有峰相對(duì)峰面積為變量，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的因子分析進(jìn)行主成分分析，以主成分的特征根及貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)。主成分個(gè)數(shù)提取原則是取主成分對(duì)應(yīng)的特征值大于1的前2個(gè)主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)可以達(dá)到87.558%，即包括了大部分信息。其中第一主成分特征值為5.977，方差貢獻(xiàn)率為59.769%；第二個(gè)主成分特征值為2.779，方差貢獻(xiàn)率為27.789%。分別以第一、第二主成分來(lái)建立坐標(biāo)系，得到所有樣本PCA二維投影圖(圖4)，圖中每一個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)產(chǎn)地，10個(gè)產(chǎn)地可分為3類。

圖3不同產(chǎn)地蟾酥藥材PCA圖

3.4 共有蜂的確認(rèn)

本研究對(duì)10批蟾酥供試品溶液進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè)，確定了10個(gè)共有峰，并通過(guò)與對(duì)照品溶液比對(duì)，指認(rèn)了其中3個(gè)色譜峰，分別為7號(hào)(蟾毒它靈)、9號(hào)(蟾毒靈)、10號(hào)(華蟾毒精)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：A.對(duì)照品；B.蟾酥樣品；7.蟾毒它靈；9.蟾毒靈；10.華蟾毒精。圖4 對(duì)照品和蟾酥樣品HPLC圖

4 結(jié)論

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物。我國(guó)分布的蟾蜍科蟾蜍屬動(dòng)物品種眾多，達(dá)十余種之多。分布最廣的是中華大蟾蜍、花背蟾蜍BuforaddeiStrauch、黑眶蟾蜍和華西蟾蜍BufobufoAndrewsi。有研究表明，不同基原動(dòng)物蟾酥成分差異顯著。不同品種蟾蜍地理上交叉分布，加上捕捉者缺乏動(dòng)物品種的準(zhǔn)確辨識(shí)，易導(dǎo)致蟾酥品種混雜現(xiàn)象以及蟾酥藥材質(zhì)量的參差不齊，從而嚴(yán)重影響藥材療效及安全性，增加臨床用藥的安全風(fēng)險(xiǎn)。

本研究收集了10批不同產(chǎn)地的蟾酥藥材，優(yōu)化色譜條件，建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜。在10個(gè)共有峰中，有3個(gè)色譜峰經(jīng)與對(duì)照品溶液比對(duì)，分別指認(rèn)為蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾毒精。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)分析不同批次蟾酥樣品的相似度為0.920～0.967，表明10批藥材相似度較高。利用PCA方法對(duì)蟾酥藥材的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析。聚類分析結(jié)果表明，10批樣品可分成3類，樣品S1、S2、S6、S7、S8、S10聚為一類，樣品S3、S9聚為一類，樣品S4、S5聚為一類，與相似度結(jié)果一致。

本研究建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜，共確定了10個(gè)共有蜂。中藥指紋圖譜可以全面反映蟾酥藥材的化學(xué)成分以及各特征性有效成分間峰面積的相對(duì)比例，進(jìn)而反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評(píng)價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用指紋圖譜結(jié)合PCA對(duì)不同產(chǎn)地蟾酥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，所建立的測(cè)定方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，可為蟾酥藥材的質(zhì)量控制和質(zhì)量鑒別提供有效手段。