成小蘭,龐中化,王志剛,胡春萍,呂章明,曹鵬
江蘇省中醫(yī)藥研究院/南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇 南京 210028
蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物,主產(chǎn)于河北、山東、四川等地。蟾酥味甘、辛,性溫,有毒,具有開(kāi)竅醒神、解毒、止痛等功效,主治惡瘡、瘰疬、癌腫、咽喉腫痛、牙痛等局部結(jié)腫及其引發(fā)的疼痛[1]。近年被用于治療急性心力衰竭、慢性支氣管炎、坐骨神經(jīng)痛等[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,蟾酥具有抗腫瘤、強(qiáng)心、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種作用[3]。最新研究顯示,蟾酥可增強(qiáng)去甲腎上腺素所引起的大鼠輸精管的收縮,并呈劑量依賴性收縮反應(yīng)。此外,蟾酥還具有鎮(zhèn)咳、利尿、興奮腸道平滑肌以及促進(jìn)糖元抑制乳酸生成的胰島素樣作用[4]。蟾酥含有大量蟾蜍毒素類物質(zhì),尚含有酯蟾毒配基-3-單辛二酸脂、蟾毒靈-3-單辛二酸酯、華蟾毒精-3-單辛二酸酯、膽固醇、吲哚系堿類等成分,其中蟾蜍毒素類成分是蟾酥的主要有效成分[5-7]。蟾酥是臨床常用的名貴動(dòng)物藥之一,應(yīng)用廣泛,療效確切。眾多成方制劑如六神丸、麝香保心丸、蟾酥注射液等均含有該藥材。由于蟾蜍基原動(dòng)物的多樣化,加之中藥大品種的技術(shù)升級(jí)以及蟾酥資源需求量的增加,蟾酥價(jià)格不斷高漲,不法商販在蟾酥中摻假以謀取暴利,導(dǎo)致市場(chǎng)商品蟾酥品種混雜、摻雜、摻假現(xiàn)象嚴(yán)重,常見(jiàn)摻偽品主要包括:淀粉、泥沙、蛋白、松香粉、牙膏、肥皂、豬油等雜質(zhì)[8]。混偽品導(dǎo)致蟾酥質(zhì)量差異較大,不能保證用藥的有效性和安全性。因此建立有效可靠的蟾酥藥材鑒定方法,用于嚴(yán)格控制蟾酥藥材及飲片的質(zhì)量顯得尤為重要。
蟾酥常用的傳統(tǒng)真?zhèn)舞b別方法包括外觀形狀鑒別和理化鑒別。但由于蟾酥經(jīng)過(guò)初加工后,缺乏基原動(dòng)物的外觀形態(tài),傳統(tǒng)鑒別法存在一定的局限性。近年來(lái),隨著DNA分子鑒定技術(shù)的發(fā)展,基于COI基因條形碼技術(shù)的藥材分子鑒定為動(dòng)物藥材的鑒別提供了全新而有效的輔助手段[9]。但由于蟾蜍是兩棲類動(dòng)物,且該兩棲類物種基因組受環(huán)境影響較大,基因組存在較大的變異性,單純依靠COI測(cè)序難以對(duì)蟾蜍進(jìn)行鑒定。此外,在蟾酥加工過(guò)程中,DNA受到較大破壞,因此難以從蟾酥中提取線粒體DNA,更增加了通過(guò)條形碼鑒定混偽品的難度。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、整體的鑒定手段,可較全面地反映藥材/飲片的化學(xué)成分以及特征峰面積的相對(duì)比例。在對(duì)藥材/飲片指紋圖譜分析的基礎(chǔ)上,采用不同的統(tǒng)計(jì)處理方法進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別,可在藥材/飲片質(zhì)量、產(chǎn)地、種屬、真?zhèn)蔚呐袆e中克服人工鑒定的主觀因素,從而更加準(zhǔn)確地對(duì)藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià),應(yīng)用廣泛[10-11]。本研究采用HPLC梯度洗脫法構(gòu)建不同產(chǎn)地蟾酥藥材指紋圖譜,并對(duì)10批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)、聚類分析和主成分分析,旨在為蟾酥的質(zhì)量控制和鑒別研究提供科學(xué)依據(jù)。
Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng),Waters2996型二極管陣列檢測(cè)器,Empower色譜工作站(美國(guó)Waters公司),METTLER AB204-S萬(wàn)分之一電子天平,METTLER AG285十萬(wàn)分之一電子天平,Milli-Q純水器(美國(guó)Millipore公司)
甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)TEDIA公司);水為超純水;其他試劑為分析純。
蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對(duì)照品由江蘇省中醫(yī)藥研究院化學(xué)研究室提供,純度>98%。
本研究所用蟾酥樣品詳見(jiàn)表1。所有樣品均由江蘇省中藥研究院中藥資源實(shí)驗(yàn)室錢(qián)士輝研究員鑒定。
表1 蟾酥樣品信息
利用高效液相色譜法,采用Waters MS C18色譜柱(250 mm×4.6mm,5 μm);流動(dòng)相:純水和0.1% TFA乙腈溶液(梯度洗脫);檢測(cè)波長(zhǎng):296 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1,進(jìn)樣體積30 μL。
表2 純水(A)-0.1% TFA乙腈(B)梯度洗脫
精密稱取蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對(duì)照品適量,分別用甲醇溶解得對(duì)照品溶液。精密吸取各對(duì)照品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品溶液。
稱取蟾酥細(xì)粉約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50 mL甲醇稱質(zhì)量,加熱回流提取1 h,放冷,加甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量,搖勻,靜置,上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),續(xù)濾液作為供試品溶液。
3.1.1 精密度試驗(yàn) 取蟾酥供試品溶液(S1),按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,采用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》分析,以蟾毒靈為參照物,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.096 0%~0.156 9%,相對(duì)峰面積RSD為0.840 6%~3.349 3%,均小于5%,符合指紋圖譜檢測(cè)要求。
3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蟾酥供試品溶液(S1)分別在0、2、4、12、24 h進(jìn)行HPLC檢測(cè),以蟾毒靈為參照物,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.263 6%~0.521 2%,相對(duì)峰面積RSD為2.414 0%~3.666 3%,表明供試液24 h內(nèi)穩(wěn)定。
3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份蟾酥樣品(S1)6份,按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,采用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》分析,以蟾毒靈為參照物,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.063 9%~0.439 0%,相對(duì)峰面積RSD為0.659 2%~4.952 0%,表明重復(fù)性良好。
3.2.1 HPLC指紋圖譜測(cè)定 取不同產(chǎn)地10批蟾酥樣品,按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 蟾酥HPLC特征圖(S1~S10)
3.2.2 對(duì)照指紋圖譜的建立和共有峰的標(biāo)定 將3.2.1條件下測(cè)定的色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件,以S1樣品為參考圖譜,時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 s,中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜(圖2)。蟾酥色譜指紋圖譜以保留時(shí)間為44.079 6 min的9號(hào)峰作為參照峰S,對(duì)不同蟾酥藥材的指紋圖譜進(jìn)行考察,共確定了10個(gè)共有峰,各共有峰面積見(jiàn)表3。
圖2 蟾酥對(duì)照指紋圖譜
表3 不同產(chǎn)地10批蟾酥藥材共有峰面積
3.2.3 指紋圖譜分析 由圖1可知,蟾酥化學(xué)成分復(fù)雜,不同產(chǎn)地蟾酥化學(xué)組成基本相似,但含量差別較大,其共有峰面積RSD為4.22%~17.31%,在10 批次樣品圖中9號(hào)色譜峰(蟾毒靈)的分離度良好,所有樣品共有且為蟾酥主要成分之一,因此將其確定為參照峰S。
3.2.4 相似度評(píng)價(jià) 使用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2012版)》對(duì)10批蟾酥藥材色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以S1樣品色譜圖譜作為參照?qǐng)D譜,采用“中位數(shù)”法生成對(duì)照?qǐng)D譜,得到10批蟾酥藥材特征圖譜及相似度。結(jié)果10批不同產(chǎn)地蟾酥藥材各色譜圖相似度在0.920~0.967,表明10批藥材相似度較好。
表4 不同產(chǎn)地蟾酥HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果
以蟾酥指紋圖譜中標(biāo)定的共有峰相對(duì)峰面積為變量,用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的因子分析進(jìn)行主成分分析,以主成分的特征根及貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)。主成分個(gè)數(shù)提取原則是取主成分對(duì)應(yīng)的特征值大于1的前2個(gè)主成分,其累計(jì)貢獻(xiàn)可以達(dá)到87.558%,即包括了大部分信息。其中第一主成分特征值為5.977,方差貢獻(xiàn)率為59.769%;第二個(gè)主成分特征值為2.779,方差貢獻(xiàn)率為27.789%。分別以第一、第二主成分來(lái)建立坐標(biāo)系,得到所有樣本PCA二維投影圖(圖4),圖中每一個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)產(chǎn)地,10個(gè)產(chǎn)地可分為3類。
圖3不同產(chǎn)地蟾酥藥材PCA圖
本研究對(duì)10批蟾酥供試品溶液進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè),確定了10個(gè)共有峰,并通過(guò)與對(duì)照品溶液比對(duì),指認(rèn)了其中3個(gè)色譜峰,分別為7號(hào)(蟾毒它靈)、9號(hào)(蟾毒靈)、10號(hào)(華蟾毒精)。結(jié)果見(jiàn)圖4。
注:A.對(duì)照品;B.蟾酥樣品;7.蟾毒它靈;9.蟾毒靈;10.華蟾毒精。圖4 對(duì)照品和蟾酥樣品HPLC圖
蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物。我國(guó)分布的蟾蜍科蟾蜍屬動(dòng)物品種眾多,達(dá)十余種之多。分布最廣的是中華大蟾蜍、花背蟾蜍BuforaddeiStrauch、黑眶蟾蜍和華西蟾蜍BufobufoAndrewsi。有研究表明,不同基原動(dòng)物蟾酥成分差異顯著。不同品種蟾蜍地理上交叉分布,加上捕捉者缺乏動(dòng)物品種的準(zhǔn)確辨識(shí),易導(dǎo)致蟾酥品種混雜現(xiàn)象以及蟾酥藥材質(zhì)量的參差不齊,從而嚴(yán)重影響藥材療效及安全性,增加臨床用藥的安全風(fēng)險(xiǎn)。
本研究收集了10批不同產(chǎn)地的蟾酥藥材,優(yōu)化色譜條件,建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜。在10個(gè)共有峰中,有3個(gè)色譜峰經(jīng)與對(duì)照品溶液比對(duì),分別指認(rèn)為蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾毒精。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)分析不同批次蟾酥樣品的相似度為0.920~0.967,表明10批藥材相似度較高。利用PCA方法對(duì)蟾酥藥材的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析。聚類分析結(jié)果表明,10批樣品可分成3類,樣品S1、S2、S6、S7、S8、S10聚為一類,樣品S3、S9聚為一類,樣品S4、S5聚為一類,與相似度結(jié)果一致。
本研究建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜,共確定了10個(gè)共有蜂。中藥指紋圖譜可以全面反映蟾酥藥材的化學(xué)成分以及各特征性有效成分間峰面積的相對(duì)比例,進(jìn)而反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量,為蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評(píng)價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用指紋圖譜結(jié)合PCA對(duì)不同產(chǎn)地蟾酥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),所建立的測(cè)定方法快速準(zhǔn)確,靈敏度高,可為蟾酥藥材的質(zhì)量控制和質(zhì)量鑒別提供有效手段。