陳強(qiáng) 章正祥 戚觀樹 周會霞 邵敏峰 黃春華

不安腿綜合征（restless legs syndrome，RLS），是一種常見的睡眠障礙疾病，以靜息狀態(tài)下雙下肢感覺異常和強(qiáng)烈的活動愿望為主，嚴(yán)重影響睡眠和生活質(zhì)量。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究發(fā)現(xiàn)多巴胺機(jī)制功能障礙是RLS的重要原因［1］。臨床上用DRD2/DRD3受體激動劑可有效控制RLS癥狀。脊髓通過多巴胺來調(diào)節(jié)運(yùn)動和感覺傳導(dǎo)，下丘腦A11核團(tuán)是脊髓灰質(zhì)中下行多巴胺通路的主要來源［2］。臨床上通過提高5-HT生物利用度來治療抑郁的同時(shí)，會引起或加重患者的RLS發(fā)作［3］，并發(fā)現(xiàn)激活5HT1B/1D受體可使運(yùn)動活性提高［4］。本研究通過毀損下丘腦A11區(qū)多巴胺神經(jīng)元制備RLS大鼠模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索多巴胺D2受體與5HT1B受體是否共同參與RLS的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 組織來源 SPF級雄性SD大鼠15只，250～350g。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司生產(chǎn)。根據(jù)體重隨機(jī)分成3組，模型組（n=6）、假手術(shù)組（n=6）、空白組（n=3）。麻醉后以前囟為定位標(biāo)志，對右側(cè)A11進(jìn)行定位鉆孔（前囟尾側(cè)3.0mm，腹側(cè)8.1mm，矢狀縫右側(cè)0.5mm）。進(jìn)針后毀損組注射4μl 0.2% 6-OHDA（含0.1%抗壞血酸），假手術(shù)組注射4μl 0.1%抗壞血酸生理鹽水，空白組不進(jìn)行任何處理。各組在第8天錄制6h行為學(xué)視頻后，通過心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛磷酸緩沖液，取大鼠腦組織，在4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液中再固定12～24h，然后用4℃30%蔗糖-PBS液脫水72h，于液氮中速凍10～15s左右，存于-80℃冰箱。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠D2多克隆抗體（324393），Calbiochem；山羊源5-HT1B受體抗體（Sc-32545），Santa Cruz；Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）（WDA0516），F(xiàn)itc標(biāo)記的驢抗山羊IgG（H+L）（WD-RAG001），由達(dá)文生物有限公司進(jìn)口美國杰克遜公司后提供；DAPI Fluoromount-G（0100-20），SouthernBiotech。

1.3 儀器 冰凍切片機(jī)（HM 550），德國美康儀器設(shè)備有限公司；激光共聚焦熒光顯微鏡（SP8），徠卡。

1.4 免疫熒光 （1）切片制備：根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版）對中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）進(jìn)行定位。每組各隨機(jī)抽取1個(gè)，在-20℃的恒溫箱中連續(xù)切片，PAG切片厚度為20μm，每個(gè)樣本取1張切片，收集于0.01M PBS液中，于4℃保存。（2）免疫熒光雙染漂片法：腦片收集于0.01M PBS液中，在搖床上漂洗10min；將腦片轉(zhuǎn)移至盛有0.01M PBS液的96孔板中，吸去PBS液后加入免疫染色封閉液，置于37℃水浴箱封閉1.5h；吸去封閉液后，加入兔源多巴胺D2受體一抗（稀釋度為1：500），置于4℃冰箱孵育過夜；置于37℃水浴箱復(fù)溫1h；PBS液搖床漂洗10min，共4次；吸去PBS液，加入1∶100 Goat anti-rabbit IgG（H+L）Cy3，置于37℃水浴箱孵育2h，此步后續(xù)操作均應(yīng)注意避光；PBS液搖床漂洗10min，共4次；吸去PBS液，加入山羊源5-HT受體一抗（稀釋度為1∶50），置于4℃冰箱孵育過夜；置于37℃水浴箱復(fù)溫1h；PBS液搖床漂洗10min，共4次；吸去PBS液，加入1∶50 Donkey anti-Goat IgG（H+L）Fitc，置于37℃水浴箱孵育2h；PBS液搖床漂洗10min，共4次；將腦片裱于載玻片上，室溫下待腦片表面液體陰干后，滴加少量含DAPI的封片劑，蓋上蓋玻片。（3）圖片分析：激光共聚焦熒光顯微鏡拍片，每張玻片輸出四個(gè)圖片，Cy3標(biāo)記的二抗結(jié)合DRD2，顯示為紅色。Fitc標(biāo)記的二抗結(jié)合的5HT1BR，顯示為綠色。DAPI染色細(xì)胞核，為藍(lán)色。同一個(gè)細(xì)胞共同表達(dá)DRD2和5HT1BR，混合顯示為棕黃色。

2 結(jié)果

免疫熒光雙染結(jié)果顯示PAG同時(shí)存在多巴胺D2受體、5HT1B受體，共存于同一細(xì)胞，見圖1-6。

圖1-1 模型組-PAG 5HT1BR（×100）；圖1-2模型組-PAG DRD2（×100）圖1-3模型組-PAG DAPI（×100）；圖1-4模型組-PAG 合并（×100）

圖2-1 模型組-PAG右側(cè)5HT1BR（×630）；圖2-2模型組-PAG右側(cè)DRD2（×630）；圖2-3模型組-PAG右側(cè)DAPI（×630）；圖2-4模型組-PAG右側(cè)合并（×630）

圖3-1 假手術(shù)組-PAG5HT1BR（×100）；圖3-2假手術(shù)組-PAG DRD2（×100）；圖3-3假手術(shù)組-PAG DAPI（×100）；圖3-4假手術(shù)組-PAG 合并（×100）

圖3-1 假手術(shù)組-PAG5HT1BR（×100）；圖3-2假手術(shù)組-PAG DRD2（×100）；圖3-3假手術(shù)組-PAG DAPI（×100）；圖3-4假手術(shù)組-PAG 合并（×100）

圖5-1 空白組-PAG 5HT1BR（×100）；圖5-2空白組-PAG DRD2（×100）；圖5-3空白組-PAG DAPI（×100）；圖5-4空白組-PAG 合并（×100）

圖6-1 空白組-PAG右側(cè)5HT1BR（×630）；圖6-2空白組-PAG右側(cè)DRD2（×630）；圖6-3空白組-PAG右側(cè)DAPI（×630）；圖6-4空白組-PAG右側(cè) 合并（×630）

3 討論

3.1 多巴胺受體在RLS中的核心作用 多巴胺受體有多種類型，其中多巴胺D2受體（DRD2）、多巴胺D3受體（DRD3）和RLS關(guān)系最密切。A11神經(jīng)元的激活降低了對有害刺激的行為反應(yīng)，這種作用是由D2型受體介導(dǎo)的［5］。目前普遍認(rèn)為RLS患者的主要病理機(jī)制為低活性多巴胺能神經(jīng)傳遞，對脊髓背角抗傷害行為反應(yīng)抑制減弱。臨床實(shí)踐中已得到證實(shí)，大部分患者對多巴胺能治療有效，服用多巴胺能拮抗劑癥狀惡化［6］，多巴胺能藥物治療RLS癥狀的短期改善由D2和D3受體介導(dǎo)［7］。對RLS患者進(jìn)行PET檢查發(fā)現(xiàn)中腦邊緣的DRD2明顯減少［8］。

3.2 5HT受體對RLS的影響 5HT通過不同的受體亞型起作用，對背角的傷害性傳播發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。其中5-HT1受體的激活產(chǎn)生抗傷害感受作用，5-HT 1B/1D受體減少單突觸和多突觸反射途徑中的感覺傳播［9］。背角的5HT來源于延髓頭端腹內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)（RVMM）的神經(jīng)元，而RVMM神經(jīng)元主要接受PAG的5-HT神經(jīng)元投射［5］。通過激活多巴胺D2樣受體可增加5-HT神經(jīng)元的活性，這不僅發(fā)生在中縫背核中，還可能存在于PAG［10］。有研究［11］發(fā)現(xiàn)不僅腹側(cè)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元在促進(jìn)覺醒中發(fā)揮著重要作用，使用5-HT1B受體激動劑也能促進(jìn)覺醒。Mccreary等［4］通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-HT 1B/1D受體拮抗劑可以通過拮抗在紋狀體和/或邊緣區(qū)域中的5-HT 1B/1D，導(dǎo)致DA釋放增強(qiáng)，活動減少。Shioda等［12］用5-HT1A受體激動劑坦度螺酮成功改善RLS患者的癥狀，可能是因?yàn)?-HT1A受體激動劑間接增加腦內(nèi)多巴胺濃度［13］從而起到治療作用。

綜上所述，五羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)與多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切，共同調(diào)節(jié)不安腿綜合征的癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)PAG共同表達(dá)多巴胺D2受體與5HT1B受體，兩者可能通過協(xié)同控制多巴胺能神經(jīng)傳遞來調(diào)控RLS，但尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。