張 權(quán)，肖 智△，秦 穎

(遵義醫(yī)科大學(xué)：1.貴州省普通高等學(xué)校腦科學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義 563000)

體表組織缺損形成的慢性創(chuàng)面是臨床外科的常見病和多發(fā)病，伴疼痛、感染和功能障礙等并發(fā)癥。目前臨床主要通過皮瓣移植、使用生物工程材料、高壓氧、電磁療法及干細(xì)胞移植等多種治療手段促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)[1-3]。但是創(chuàng)面修復(fù)區(qū)往往出現(xiàn)觸、壓、溫、痛等感覺功能的減退甚至消失。有研究提示，觸壓覺功能的缺失是導(dǎo)致創(chuàng)面修復(fù)失敗的重要原因之一[4]。觸覺與默克爾細(xì)胞(Merkel細(xì)胞)分布有關(guān)，該細(xì)胞存在于表皮與真皮交界的網(wǎng)狀脊上，與真皮層Aβ類感覺傳入神經(jīng)纖維末梢緊密接觸，并形成類似于神經(jīng)解剖上的突觸結(jié)構(gòu)，稱為Merkel細(xì)胞-神經(jīng)突復(fù)合體[5-6]。該復(fù)合體在皮膚觸覺高敏感區(qū)域數(shù)量較多，例如老鼠的須墊、硬腭和背部皮膚及人體的指腹、嘴唇等[7]。濕潤燒傷膏(moist exposed burn ointment，MEBO)應(yīng)用到創(chuàng)面是以液化的方式無損傷地排除壞死組織，以原位干細(xì)胞培植的方式再生修復(fù)創(chuàng)面[8]；此外，MEBO還具有雙向調(diào)節(jié)作用[9]，在創(chuàng)面愈合過程的早期具有“保濕”和促進(jìn)“生肌”的作用。雖有大量文獻(xiàn)報(bào)道MEBO促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，但針對(duì)MEBO在創(chuàng)面神經(jīng)再生及觸覺重建方面的研究卻鮮見報(bào)道。通過本研究一方面可以加深對(duì)觸覺形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)，另一方面，可以為臨床使用MEBO促進(jìn)創(chuàng)面觸覺功能重建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 無特殊病原體(SPF)級(jí)成年健康SD雄性大鼠共60只，體質(zhì)量240～260 g，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016。大鼠每4只一籠飼養(yǎng)，置于溫度(25±2)℃、濕度(52±2)%環(huán)境中自由飲食，自然采光，適應(yīng)環(huán)境1周。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組(N組)、創(chuàng)面7 d組(D7組)、創(chuàng)面14 d組(D14組)、MEBO治療7 d組(MEBO7組)和MEBO治療14 d組(MEBO14組)。N組大鼠不做任何處理；D7組、D14組、MEBO7組和MEBO14組大鼠建立足底全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面模型，其中MEBO7組和MEBO14組大鼠建模后每6～8小時(shí)用無菌棉簽將MEBO涂于足底創(chuàng)面，厚約1 mm，創(chuàng)面上加蓋兩層MEBO涂抹的濕潤消毒紗布，用膠布固定治療，每天換藥3～4次。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理綱要進(jìn)行操作，研究中盡量減少動(dòng)物使用量和動(dòng)物所承受的痛苦。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 MEBO(汕頭市美寶制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1703903A)。兔抗大鼠細(xì)胞角蛋白20(CK-20)單克隆抗體(美國Abcam公司，貨號(hào)：ab76126)、3%牛血清清蛋白、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、抗體稀釋液、RIPA裂解液均購于碧云天生物有限公司，水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠)；冰凍切片機(jī)(Leica-CM1950型，德國Leica公司)，Von Frey針刺痛覺測(cè)試套件Aesthesio(香港友誠生物科技有限公司)，倒置熒光顯微鏡(IX53+DP73型，日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1足底創(chuàng)面大鼠模型建立 大鼠腹腔內(nèi)注射4%水合氯醛(10 mL/kg)，麻醉成功后，大鼠足底用0.5 %聚維酮碘溶液消毒后切除深度達(dá)筋膜層6 mm×5 mm的皮膚全層，建立足底全層皮膚缺損大鼠模型。大鼠清醒后單獨(dú)分籠飼養(yǎng)。

1.2.2觸覺功能檢測(cè) 將大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明有機(jī)玻璃罩，適應(yīng)環(huán)境30 min。待大鼠探索行為結(jié)束后進(jìn)行觸覺功能檢測(cè)。觸覺測(cè)定采用Von Frey纖維絲，將纖維絲頭端垂直接觸大鼠足底，使尖端略彎曲，每次刺激持續(xù)時(shí)間最長不超過2 s，若在規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠出現(xiàn)縮足反射或足部肌肉收縮，則更換相鄰小一級(jí)纖維絲；若大鼠未出現(xiàn)縮足反射或足部肌肉收縮，則替換大一級(jí)纖維絲刺激，相鄰測(cè)試時(shí)間間隔10 s。檢測(cè)前去除足底創(chuàng)面的壞死組織，檢測(cè)區(qū)域固定在足底創(chuàng)面中央。檢測(cè)時(shí)間為建模前(0 d)和建模后7、14 d。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織CK-20陽性細(xì)胞 按照隨機(jī)數(shù)字表法取建模后7 d或14 d的各組大鼠(n=6)，4%水合氯醛(20 mL/kg)腹腔內(nèi)注射，深度麻醉后，剔除壞死組織，取大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織，沿皮面平行切下肉芽組織后按分組分別置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃冰箱保存4 h后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖多聚甲醛溶液中(4 ℃保存)，8～10 h沉底后取出足底肉芽組織，用OCT包埋劑(Sakura Tissue-Tek型，美國櫻花公司)包埋后置于-20 ℃冰凍切片機(jī)中50 min。沿冠狀位連續(xù)切片，厚25 μm。每4～5張皮膚切片取1張進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析，每只大鼠取10張。皮片磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗和血清封閉后加入一抗(兔抗大鼠CK-20抗體)和二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG (H+L)]；DAB顯色，梯度乙醇脫水，生物透明劑透明后封片，光鏡下觀察并采集圖像。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)對(duì)皮膚CK-20陽性圖片進(jìn)行CK-20受體陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。每張取5個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)每一個(gè)視野中的CK-20陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)組織CK-20表達(dá)水平 取建模后7 d或14 d每組大鼠(n=6)，足底新生肉芽組織取材方法同免疫組織化學(xué)，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ〕銎つw新生肉芽組織稱重，研碎后加入RIPA裂解液(含PMSF，1∶100)，超聲波粉碎；離心后取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量(蛋白定量為100 μg/μL)；2倍上樣緩沖液與樣品(1∶1)煮沸8 min，離心，-20 ℃冰箱保存。配膠，各泳道取20 μL(每條泳道蛋白含量20 μg)加樣，電泳后，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，TBST封閉1 h。加入一抗：兔抗大鼠CK-20抗體(1∶5 000)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶2 000)，4 ℃冰箱孵育，過夜后洗膜，加入二抗，室溫孵育、洗膜?；瘜W(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑與PVDF膜共孵育后顯影、定影。圖像進(jìn)行目標(biāo)條帶掃描(方正掃描儀F5600)，Bio-Rad生物圖像處理系統(tǒng)(PDQUEST)進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，對(duì)所測(cè)目標(biāo)蛋白的條帶吸光度值(A值)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到各組CK-20蛋白相對(duì)吸光度值(RA值)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠足底創(chuàng)面觸覺功能變化 用Von Frey纖維絲檢測(cè)各組大鼠足底觸覺閾值。建模前，各組大鼠觸覺閾值均值為(4.03±0.35)g，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察時(shí)間內(nèi)N組大鼠觸覺閾值相對(duì)變化不大，為(4.07±0.39)g；D7組觸覺閾值為(43.22±9.16)g，D14組觸覺閾值為(11.43±2.45)g，D7組、D14組分別與N組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MEBO7組觸覺閾值為(8.54±1.05)g，MEBO14組觸覺閾值為(4.75±0.97)g，MEBO7組、MEBO14組分別與N組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MEBO7組與D7組比較，MEBO14組與D14組比較，觸覺閾值均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。均數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=208.9，P=0.000)，見圖1。

*：P<0.05，與N組比較；#：P<0.05，與D7組比較；△：P<0.05，與MEBO7組比較；▲：P<0.05，與D14組比較

圖1各組大鼠觸覺閾值比較

A：N組；B：D7組；C：MEBO7組；D：D14組；E：MEBO14組；F：各組大鼠足底正常皮膚或創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20陽性細(xì)胞數(shù)比較；*：P<0.05，與N組比較；#：P<0.05，與D 7組比較；△：P<0.05，與MEBO7組比較；▲：P<0.01，與D 14組比較；圖中紅色箭頭所示：CK-20免疫陽性細(xì)胞(免疫組化染色，標(biāo)尺為100 μm)

圖2各組大鼠足底正常皮膚組織或創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20陽性細(xì)胞表達(dá)

2.2大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20陽性的Merkel細(xì)胞數(shù)量變化 足底正?；騽?chuàng)面新生肉芽組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，位于皮膚表皮與真皮交界面的網(wǎng)狀脊尖端有成串的CK-20陽性細(xì)胞表達(dá)，見圖2。N組大鼠CK-20陽性細(xì)胞表達(dá)排列整齊，染色較深；與N組大鼠比較，D7組和D14組CK-20陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少且D7組大鼠CK-20陽性細(xì)胞排列紊亂；創(chuàng)面經(jīng)多次涂抹MEBO后，MEBO7組和MEBO14組大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20陽性細(xì)胞數(shù)較同觀察時(shí)間點(diǎn)的D7組和D14組增多，但仍低于N組；MEBO7組與MEBO14組大鼠比較，MEBO14組大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20陽性細(xì)胞數(shù)增多。均數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.340，P=0.001)，見圖2。

2.3大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20蛋白水平變化 Western blot檢測(cè)大鼠正?；蜃愕讋?chuàng)面新生肉芽組織發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為48×103的陽性條帶，與目標(biāo)蛋白CK-20的相對(duì)分子質(zhì)量吻合。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，對(duì)所測(cè)目標(biāo)蛋白的條帶A值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到各組大鼠CK-20蛋白R(shí)A值。與N組比較，D7組和D14組足底組織CK-20蛋白R(shí)A值明顯下降；創(chuàng)面經(jīng)多次涂抹MEBO后，MEBO7組和MEBO14組CK-20蛋白R(shí)A值較同觀察時(shí)間點(diǎn)的D7組和D14組增多，但仍低于N組，均數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.74，P=0.000)，見圖3。

A：各組大鼠足底正常皮膚或創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20蛋白Western blot條帶；B：定量統(tǒng)計(jì)；*：P<0.05，與N組比較；#：P<0.05，與D7組比較；△：P<0.05，與MEBO7組比較；▲：P<0.05，與D14組比較

圖3各組大鼠足底正常皮膚或創(chuàng)面新生肉芽組織CK-20蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

高等生物的皮膚是體內(nèi)與體外環(huán)境接觸的重要媒介，皮膚上存在大量復(fù)雜的觸覺感受器感知外環(huán)境的變化刺激。觸覺感受器可以通過機(jī)械激活的離子通道把壓力、張力等機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺芷魃系碾娦盘?hào)形成感受器電位，并將經(jīng)編碼的電信號(hào)通過傳入神經(jīng)投射到高級(jí)神經(jīng)中樞(皮層軀體感覺中樞)，產(chǎn)生觸摸感覺。通常認(rèn)為，Merkel細(xì)胞神經(jīng)突復(fù)合體是Merkel細(xì)胞與Aβ傳入纖維末梢形成突觸樣結(jié)構(gòu)，感受器電位通過Aβ傳入纖維傳入，并將物體的形狀、質(zhì)地及空間屬性等進(jìn)行編碼[10-12]。大鼠Merkel基因敲除或沉默后，大鼠足底無毛區(qū)不能辨別物體表面紋理、質(zhì)地，但是大鼠胡須區(qū)仍然保留上述鑒別能力，表明Merkel細(xì)胞-神經(jīng)突復(fù)合體對(duì)保持手掌、足底等無毛區(qū)對(duì)物體的鑒別能力是必須的，而對(duì)胡須區(qū)的觸覺無明顯作用[13-14]。

Merkel細(xì)胞具有特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如共表達(dá)內(nèi)分泌顆粒、角蛋白絲和橋粒蛋白。常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色很難在鏡下區(qū)分Merkel細(xì)胞，有文獻(xiàn)報(bào)道，在體鑒定Merkel細(xì)胞的主要方法是采用抗角蛋白抗體，其中在胎兒和成人皮膚中，僅僅Merkel細(xì)胞表達(dá)CK-20，因此，CK-20可以作為Merkel細(xì)胞的標(biāo)記蛋白[15-16]。本研究采用免疫組織化學(xué)法標(biāo)記CK-20表達(dá)陽性的方法鑒定Merkel細(xì)胞，結(jié)果顯示在正常大鼠網(wǎng)狀脊或建模大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織中均有CK-20陽性細(xì)胞表達(dá)。有研究提示，組織中Merkel細(xì)胞數(shù)量會(huì)根據(jù)環(huán)境的變化上升或下降，作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)，例如：隨著毛囊周期的變化，Merkel細(xì)胞數(shù)量和分布出現(xiàn)生理性波動(dòng)[16]；此外，在不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子作用下，Merkel細(xì)胞數(shù)量也會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)[17]。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，大鼠切除足底皮膚后，其足底觸覺閾值顯著升高，創(chuàng)面新生肉芽組織中CK-20陽性的Merkel細(xì)胞數(shù)量減少，CK-20蛋白水平降低，此現(xiàn)象可能與足底創(chuàng)面形成導(dǎo)致創(chuàng)面新生肉芽組織中Merkel細(xì)胞丟失有關(guān)。研究還顯示，大鼠足底創(chuàng)面建模后7 d與14 d比較，在創(chuàng)面逐漸愈合的過程中，足底創(chuàng)面觸覺閾值逐漸降低，創(chuàng)面新生肉芽組織中CK-20陽性的Merkel細(xì)胞數(shù)量增加，CK-20蛋白水平上調(diào)，其機(jī)制可能與足底創(chuàng)面愈合過程中局部多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)肽等物質(zhì)促進(jìn)Merkel細(xì)胞生成有關(guān)，究竟哪些因子促進(jìn)CK-20陽性Merkel細(xì)胞數(shù)量增加，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

祖國醫(yī)學(xué)通過辨證論治，將中藥制劑外用于皮膚創(chuàng)面，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合和功能的恢復(fù)。MEBO是一種中藥制劑，主要由黃芩、黃柏、黃連、蜂蜜、麻油等組成，有清熱燥濕，瀉火解毒、去腐生肌的功能，是一種具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的雙向調(diào)節(jié)作用的藥物，能向受損的機(jī)體局部皮膚組織殘存細(xì)胞提供維持正常生長的環(huán)境和促進(jìn)分裂再生的條件。該藥膏治療皮膚缺損有良好的止痛、抗感染、改善局部微循環(huán)、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、清除壞死組織等功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與未用MEBO治療的建模大鼠比較，在相同的觀察時(shí)間點(diǎn)，建模大鼠足底創(chuàng)面外用MEBO后，其創(chuàng)面新生肉芽組織中CK-20陽性的Merkel細(xì)胞數(shù)量增加，CK-20蛋白水平上調(diào)，創(chuàng)面觸覺閾值降低。有研究提示，Merkel細(xì)胞不表達(dá)細(xì)胞周期蛋白，因此，Merkel細(xì)胞可能分化來源于周圍未分化的多能基底角質(zhì)細(xì)胞(pluripotential basal keratinocytes)[18]，因此，外用MEBO可能通過促進(jìn)多能基底角質(zhì)細(xì)胞分化為Merkel細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面觸覺功能的重建，本設(shè)想還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，采用皮膚創(chuàng)面外用MEBO能夠有效促進(jìn)創(chuàng)面新生肉芽組織觸覺功能重建。