張佳歡 李智慧 石森林 葛衛(wèi)紅 吳素香

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 311402

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁組成，桂枝為君藥，赤芍和牡丹皮等為臣藥，主要有效成分分別為肉桂酸、芍藥苷和丹皮酚等，其極性差別較大，溶解性能不同。丸劑是一種傳統(tǒng)劑型，多為復(fù)方，成分復(fù)雜，體外溶出研究對其質(zhì)量評價意義重大。本文測定了桂枝茯苓方大蜜丸、小蜜丸、水泛丸、濃縮丸和蠟丸的體外溶出度，采用相似因子f2對5種丸劑的溶出曲線進行比較，為桂枝茯苓丸的質(zhì)量控制和評價提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器：高效液相色譜儀（德國Kanuer，LUMTECH，檢測器 UV DETECTOR K-2501）；Hypersol C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，大連依利特）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP-211D分析電子天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；ZRS-6G型智能釋放試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；DFY-400搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 藥品及試劑：肉桂酸對照品（批號：110786-200503）購自中國藥品生物制品檢定所；芍藥苷對照品（批號：YY20100505），丹皮酚對照品（批號：20110422）均購自上海源葉生物科技有限公司；桂枝茯苓丸均為實驗室自制（批號如下：大蜜丸：1203201，小蜜丸：1203202、水泛丸：1203203，濃縮丸：120225、120318、120426，蠟丸：1203205）；甲醇、乙腈為色譜純；純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱為Hypersol C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫（0～17min，14%A～45%A；17～24min，45%A～44%A；24～26min，44%A～14%A)，流速為 1.0ml/min，柱溫30℃；檢測波長在0～17min時為230nm，17～26min時為274nm；進樣量20μl。上述色譜條件下，桂枝茯苓丸中肉桂酸、丹皮酚以及芍藥苷色譜成分峰與其他成分色譜峰分離度良好，見圖1。

圖1 桂枝茯苓丸HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液制備：精密稱取肉桂酸、芍藥苷及丹皮酚對照品適量，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別制成肉桂酸0.5mg/ml、芍藥苷2.5mg/ml及丹皮酚2.5mg/ml的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備：按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0931溶出度與釋放度測定法第二法（槳法），溶出條件為pH1.2的溶出介質(zhì)900ml，溫度37±0.5℃，轉(zhuǎn)速100r/min。取桂枝茯苓濃縮丸6份，分別投入6個溶出杯內(nèi)，立即啟動并開始計時，在規(guī)定時間點吸取溶液適量，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液制備：根據(jù)桂枝茯苓丸處方比例，按“2.3”方法制成缺桂枝、赤芍、牡丹皮的陰性對照溶液。

2.5 專屬性實驗：取對照品溶液、陰性對照品溶液和供試品溶液各20μl，進樣，按照“2.1項”下色譜條件進行測定，結(jié)果表明在肉桂酸、芍藥苷以及丹皮酚的保留時間處，陰性對照無干擾，說明專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察：精密吸取混合對照品溶液適量，分別置于10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列濃度的混合對照品溶液，肉桂酸0.0005、0.0025、0.005、0.025、0.05、0.06mg/ml；芍 藥 苷0.0075、0.0375、0.075、0.375、0.75、0.9mg/ml；丹皮酚0.0075、0.0375、0.075、0.375、0.75、0.9mg/ml。按“2.1”下色譜條件分別進樣20μl，以對照品的濃度X（mg/ml）為橫坐標，對照品色譜峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結(jié)果得肉桂酸標準曲線方程Y=215.06X+39.87，r=0.9994，芍藥苷標準曲線方程Y=94.25X+40.63，r=0.9996，丹皮酚標準曲線方程Y=27.20X+19.64，r=0.9997。上述色譜條件下，肉桂酸 0.0005～0.06mg/ml，芍藥苷0.0075～0.9mg/ml，丹皮酚0.0075～0.9mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性相關(guān)性。

2.7 體外溶出試驗：取桂枝茯苓丸，按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0931溶出度與釋放度測定法第二法（槳法），pH1.2的溶出介質(zhì)900ml，轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度為37±0.5℃，依法測定。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12h取樣5.0ml（同時補充等溫等量溶出介質(zhì))，離心，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20μl進樣測定，計算累積溶出度。

2.8 不同丸劑的體外溶出比較：分別測定不同丸劑在pH1.2溶出介質(zhì)中的溶出度，以時間為橫坐標，累積溶出度為縱坐標，繪制溶出曲線。結(jié)果如圖2、圖3。2h內(nèi)溶出速率較快的是濃縮丸、水泛丸和小蜜丸，濃縮丸＞水泛丸＞小蜜丸，2～4h累積溶出度增值較大的是大蜜丸，而蠟丸釋放速率及最終累積溶出度都相對較小。

2.9 溶出曲線相似因子擬合及溶出差異比較：為更精確地對不同丸劑的溶出度進行比較，本文采用相似因子法對各溶出曲線進行分析。相似因子法基本公式：

f2為相似因子，如果50≤f2≤100，表示兩制劑的溶出度相似，越接近100，相似程度越高，無顯著性差異。其中R t，Tt分別為各時間點參比制劑和供試制劑的溶出度，n為測試點數(shù)。根據(jù)公式，計算濃縮丸、大蜜丸、小蜜丸、水泛丸及蠟丸的f2。結(jié)果見表1，由表可得，以濃縮丸為參比制劑，水泛丸中肉桂酸、芍藥苷和丹皮酚的相似因子f2均＞50，表明水泛丸中肉桂酸、芍藥苷和丹皮酚的溶出度與濃縮丸中肉桂酸、芍藥苷和丹皮酚基本相似。以大蜜丸為參比制劑，小蜜丸中肉桂酸、芍藥苷和丹皮酚的相似因子f2均＞50，表明小蜜丸中肉桂酸、芍藥苷和丹皮酚的溶出度與大蜜丸中肉桂酸、芍藥苷和丹皮酚基本相似。因此，可初步認定水泛丸和濃縮丸的溶出度基本相似；大蜜丸和小蜜丸中各指標成分溶出度基本相似；而大蜜丸、小蜜丸和蠟丸中各指標成分與濃縮丸各指標成分的溶出度有較大差異。

表1 桂枝茯苓丸相似因子f2擬合結(jié)果

3 討論

桂枝茯苓丸溶出曲線中10h后測定丹皮酚的累積釋放度有所降低，分析原因可能是因為丹皮酚的不穩(wěn)定性所致[1]。此外，各丸劑均有緩釋特征，小蜜丸、水泛丸及濃縮丸前期的體外釋放速度較快，2h后開始緩慢釋放；而大蜜丸、蠟丸在2～4h時間段的釋放速率達到最大。結(jié)果顯示大蜜丸能夠持續(xù)較長時間發(fā)揮藥效，但蠟丸的累積釋放度相對最低，分析其原因，可能是因為輔料石蠟為水不溶性物質(zhì)，將藥材包裹后有效成分的溶出比較困難。一般來說，體外溶出度是評價不同品種藥品質(zhì)量的重要依據(jù)，食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）推薦使用相似因子法評價試驗藥品與對照藥品間的溶出度差異，且認定試驗藥品的相似因子f2＞50為等效[2-3]。由實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種不同的劑型丸劑的指標成分溶出行為并不一致，存在顯著性差異，這也表明了桂枝茯苓丸劑型的改變會影響有效成分的溶出行為，繼而影響藥物療效。