孔新平，周 磊，王漢鼎，吳慶俠，董海龍

（西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000）

腸球菌屬細(xì)菌為G+球菌，常成對(duì)或短鏈，腸球菌屬有糞腸球菌、屎腸球菌等19種。作為人和動(dòng)物腸道的正常菌群，一般情況下腸球菌并不引起疾病，但在人或動(dòng)物機(jī)體抵抗能力不強(qiáng)的情況下，它就會(huì)成為條件致病菌引起人或動(dòng)物機(jī)體患病。此外，由于腸球菌的固有耐藥性以及因人類對(duì)抗生素的濫用獲得性耐藥性的產(chǎn)生，腸球菌對(duì)于抗生素的耐藥情況愈發(fā)嚴(yán)重[1]。本次試驗(yàn)對(duì)從西藏山南地區(qū)采集到病死牦牛肝臟上分離到的試驗(yàn)菌株進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定耐藥性檢測(cè)，將為西藏自治區(qū)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)以及山南地區(qū)牦牛養(yǎng)殖和臨床用藥提供一定指導(dǎo)。同時(shí)，本次試驗(yàn)利用枯草芽孢桿菌替代傳統(tǒng)抗生素來(lái)治療糞腸球菌導(dǎo)致的腹瀉，將為解決糞腸球菌臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源 對(duì)西藏山南地區(qū)一頭病死牦牛進(jìn)行尸體剖檢，無(wú)菌采集牦牛肝臟放入密封袋中，置于冰盒后迅速送往試驗(yàn)室，-20℃冰箱保存待檢。

1.1.2 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、綿羊血液、生化鑒定管（購(gòu)自杭州濱河微生物試劑公司）、2×Es Taq MasterMix（Dye）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、50×TAE、Maker、核酸染料（購(gòu)自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、搖床、烘箱、超凈工作臺(tái)、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、普通光學(xué)顯微鏡、電泳儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 將病料充分研磨后離心，采集上清接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃搖床80r/min培養(yǎng)24 h。勾取菌液劃線接種于5%血瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。勾取典型單菌落再次接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃搖床80r/min培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。將菌液劃線接種于普通瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行純化，將典型單菌落接種于肉湯培養(yǎng)24 h后，50%甘油菌液以1：1的比例保菌，并將該菌株命名為BYP。

1.2.2 生化鑒定 用移液槍吸取純化后菌液20 ul接種于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、硫化氫、枸櫞酸鹽、硝酸鹽（還原）生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24 h后觀察顏色變化對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.3 PCR鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌模板DNA，保存于-20℃；使用細(xì)菌16S rRNA通用性引物，27F-/1492R（合成自武漢擎科創(chuàng)新科技公司）。PCR反應(yīng)體系為25ul，其中2×Es Taq MasterMix（Dye）12.5ul、上游引物1ul、下游引物1ul、細(xì)菌模板DNA 1ul、ddH2O 9.5ul配足體系；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min[3]。

PCR擴(kuò)增結(jié)束之后將產(chǎn)物產(chǎn)物于1%瓊脂糖中進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，之后于凝膠成像系統(tǒng)300 nm下觀察電泳情況并采集圖片。

1.2.4 DNA序列分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往武漢生工網(wǎng)點(diǎn)進(jìn)行雙向測(cè)通，測(cè)序拼接結(jié)果經(jīng)BLAST進(jìn)行比對(duì)，并使用MegAlign軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank下載序列進(jìn)行同源性分析，并用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 吸取200 ul細(xì)菌24 h純培養(yǎng)菌液移到普通瓊脂上面，并使用無(wú)菌涂布棒將菌液涂布均勻，最后棄去多余菌液，使用無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片貼于平皿中，輕輕下壓藥敏紙片，同時(shí)注意藥敏紙片之間的距離適當(dāng)，培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，依據(jù)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判定[2]。

1.2.6 動(dòng)物試驗(yàn) 從林芝市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)置健康家兔4只，將其隨機(jī)分成2組，一組為試驗(yàn)組，一組為對(duì)照組。正常飼喂一段時(shí)間，周期為兩周。在此期間，保持兔舍衛(wèi)生狀況、通風(fēng)良好，飼料、飲水充足。兩周之后，將腸球菌BYP經(jīng)37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)8h后的菌液對(duì)4只家兔進(jìn)行腹腔注射，菌液濃度為2.7×109cfu/ml，5 ml/只，1次/d，連續(xù)注射4d[5]。在四只兔子出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象時(shí)，對(duì)試驗(yàn)組家兔灌服試驗(yàn)室保存的一株耐酸耐膽鹽的枯草芽孢桿菌[7]，灌服劑量均為20 ml/只，1次/d，連續(xù)給藥7d。對(duì)照組家兔不予處理。在此期間應(yīng)及時(shí)對(duì)兔子進(jìn)行觀察并記錄。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

初次將增殖后的菌液劃線接種于5%血瓊脂平板后有輕微溶血現(xiàn)象；在麥康凱培養(yǎng)基上可形成粉紅色小菌落；在5%血清瓊脂平板上生長(zhǎng)良好。革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)藍(lán)紫色革蘭氏陽(yáng)性球菌，常成對(duì)，也可見(jiàn)單個(gè)分布或鏈狀排列，無(wú)芽孢（圖1）。

圖1 細(xì)菌鏡檢結(jié)果（100×10）

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株能利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖，甘露醇，硫化氫、枸櫞酸鹽、硝酸鹽（還原）均呈陰性（表1）。

表1 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)300nm下對(duì)圖像進(jìn)行掃描，可以清楚看到16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為1.5kb左右的條帶，于預(yù)期片段大小結(jié)果相符（圖2），說(shuō)明細(xì)菌的16S rDNA序列被成功擴(kuò)增[4]。

圖2 BYP 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 DNA序列分析

此次16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序方式為雙向測(cè)通，測(cè)序結(jié)果出來(lái)后使用chromas軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接，拼接后序列長(zhǎng)度為1 464 bp，與預(yù)期相符，使用MegAlign將序列進(jìn)行同源性分析，如圖3所示，菌株BYP與登錄號(hào)為NR_113257、NR_113900、NR_036922、NR_075022、NR_113574、NR_113256、NR_037082、NR_114742、NR_114452的序列的同源性均在99.0%以上，可以認(rèn)定它們?yōu)橥晃锓N，即可以確定菌株BYP屬于腸球菌屬[4]。同時(shí)由圖4所構(gòu)建的菌株BYP的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，所分離到的腸球菌BYP與登錄號(hào)為NR_075022的菌株屬同一支，即親緣關(guān)系最近。

圖3 BYP 16S rDNA基因序列同源性

圖4 BYP 16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 西藏牦牛源腸球菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑大小并依據(jù)CNSL標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿莫西林青霉素G、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、紅霉素、萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出敏感，對(duì)氨芐西林、苯唑西林表現(xiàn)出耐藥（表2）。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)

對(duì)家兔進(jìn)行腹腔注射腸球菌4天后，四只家兔均出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，精神沉郁、食欲寡歡、被毛粗亂。對(duì)照組兔子不予處理，七天后均死亡，死后對(duì)其進(jìn)行尸體剖檢，發(fā)現(xiàn)其腸道出現(xiàn)充血現(xiàn)象，腸系膜一扯就破，肝臟輕微腫大，形體極度消瘦。試驗(yàn)組兔子灌服枯草芽孢桿菌后，漸漸好轉(zhuǎn)，腹瀉現(xiàn)象消失恢復(fù)健康。說(shuō)明枯草芽孢桿菌對(duì)于治療腸球菌所導(dǎo)致的家兔腹瀉有治療效果[6]。

3 討論與分析

本次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)從西藏山南地區(qū)病死牦牛肝臟中分離到的一株病原菌進(jìn)行生化鑒定，16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，證明所分離到該株病原菌為屬于腸球菌屬。但是由于屎腸球菌菌群各種細(xì)菌16S rDNA序列同源性處于98.7%～99.7%之間，所以BYP屬于何種還需通過(guò)種特異性引物的PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定[7]。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株對(duì)，對(duì)氨芐西林、苯唑西林表現(xiàn)出固有耐藥性，而對(duì)慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿莫西林青霉素G、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、紅霉素、萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出敏感。在此試驗(yàn)中，盡管腸球菌對(duì)慶大霉素和卡那霉素十分敏感，但在臨床上無(wú)效。除非做氨基糖苷類藥物的高濃度篩選。

近年來(lái)隨著抗生素的濫用以及細(xì)菌之間耐藥基因轉(zhuǎn)移，西藏地區(qū)細(xì)菌耐藥性情況日益加重[8]，探求細(xì)菌耐藥機(jī)制以及解決方法成為熱點(diǎn)，因而尋找出一種防止細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的治療方法變得尤為重要。而益生菌就成為了一種好的選擇。本次動(dòng)物試驗(yàn)中對(duì)健康家兔使用BYP進(jìn)行攻毒試驗(yàn)使其腹瀉，再使用一株耐酸耐膽鹽的枯草芽孢桿菌替代抗生素來(lái)治療家兔腹瀉，治療效果良好。證明枯草芽孢桿菌在一定程度上可以作為臨床上抗生素的替代品。這就避免了由于使用抗生素或可能產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題，為今后腸球菌治療提供了新思路。