劉 紅,黎 琴,胡尚連,王 丹,陳 浩,黃 敏,趙 博,,*

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010;2.輻照保藏四川省重點實驗室,四川成都 610101)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)屬蕓香科(Rutaceae)植物,富含多種人體所需的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì),具有較高營養(yǎng)價值[1-2]。在我國,隨著其種植面積和產(chǎn)量的快速增長,柑橘已成為重要的優(yōu)勢經(jīng)濟(jì)農(nóng)產(chǎn)品之一,且90%以上以鮮銷為主[3]。然而由于柑橘成熟期集中、主產(chǎn)區(qū)偏遠(yuǎn),故需要一定的貯藏和運(yùn)輸手段來調(diào)節(jié)市場供求。在采后貯藏期間,柑橘常常由于腐爛造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5],而造成柑橘果實在采后腐爛的主要原因是真菌引起的侵染性病害,如青霉病、綠霉病、炭疽病等,其中,由指狀青霉(Penicilliumdigitatum)引起的綠霉病危害最大[6-8]。目前,生產(chǎn)上用于防治柑橘采后病害的手段有生物防治[9-11]、化學(xué)防治[5,12]、物理防治[13-15]等。其中以化學(xué)防治為主,但長期使用化學(xué)殺菌劑不僅會使病原微生物產(chǎn)生抗藥性,還會導(dǎo)致果實中藥物殘留而危害人體健康,因此尋找生態(tài)友好、安全可靠的保鮮技術(shù)替代化學(xué)殺菌劑日益迫切[16-17]。

輻照滅菌技術(shù)作為一種新興有效的技術(shù),引起了許多研究者的關(guān)注,且在很多領(lǐng)域得到大量應(yīng)用[18-20]。輻照滅菌技術(shù)是指利用各種射線或電子束等殺滅微生物的過程[21]。γ-輻照是電離輻射中能量最高的一種形式,廣泛應(yīng)用于食品滅菌[22-23]、食品保鮮[24-26]、毒素降解[27-28]、食品加工[29-30]以及誘變育種[31]等。同時γ-輻照還具有無殘留、無污染、低能耗、安全衛(wèi)生等優(yōu)點。

本研究通過γ-輻照的手段來處理指狀青霉,通過檢測輻照后指狀青霉的生長情況、細(xì)胞膜滲透性、總糖、可溶性蛋白質(zhì)含量以及蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)活性,探究γ-輻照對指狀青霉生長及其代謝的影響,并以椪柑果實為例,研究γ-輻照對其保鮮效果的影響,為γ-輻照技術(shù)在柑橘采后貯藏保鮮上的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椪柑果實 采自綿陽市河邊鎮(zhèn)一管理良好的果園;指狀青霉病菌 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;蘋果酸脫氫酶測試盒、琥珀酸脫氫酶測試盒 南京建成生物工程研究所;其它所需化學(xué)試劑 (分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑成都有限公司;PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基 實驗室自制。

BS-4G恒溫培養(yǎng)振蕩箱 金壇市精達(dá)儀器制造有限公司;5702R超速離心機(jī) Eppendor公司;雷磁DDSJ-319L型電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司;BSA-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;EU-2200紫外分光光度計 上海昂拉儀器有限公司;HHS-1000超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;MLS-3750高壓滅菌鍋 三洋電機(jī)株式會社;GXH-3010E便攜式紅外線CO2分析儀 北京華云分析儀器有限公司;糖度計0～50%手持折光儀 浙江力辰儀器科技有限公司;60Coγ-射線輻照處理 中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所輻照中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 指狀青霉菌種活化及分生孢子懸浮液的制備 在無菌環(huán)境下,挑取指狀青霉白色菌絲少許,接種于制備好的PDA培養(yǎng)基上,置于28 ℃恒溫箱中,培養(yǎng)7 d后,即得活化的指狀青霉菌種。在無菌條件下,使用接種環(huán)將培養(yǎng)皿中全部菌種集中于角落(期間可加無菌水便于集中),倒入含玻璃珠的無菌三角瓶,無菌水沖洗殘渣,得5 mL孢子原液;隨之手搖三角瓶(打散孢子);再將紗布放在漏斗上,并用脫脂棉堵住漏斗洞口,過濾;最后,用無菌水過濾殘渣,稀釋即得25 mL分生孢子懸浮液(菌懸液)。

1.2.2 輻照處理 分別用強(qiáng)度為0.25、0.50、0.75、1.00 kGy的γ-射線對稀釋菌懸液進(jìn)行輻照,輻射源強(qiáng)度為2.3×105Ci,劑量率約為33 Gy/min,輻照處理時間約為120 min,輻照強(qiáng)度為吸收劑量,未做輻照處理的稀釋菌懸液作為空白對照。

1.2.3 輻照對指狀青霉生長的影響 將經(jīng)不同強(qiáng)度γ-射線輻照后的指狀青霉菌懸液接種于PDA培養(yǎng)基上,未做輻照處理的稀釋菌懸液作為空白對照,生長5 d后,借助直徑為5 mm的無菌打孔器取指狀青霉菌餅,移入PDA培養(yǎng)基,用鑷子或接種針固定于PDA培養(yǎng)基正中位置,培養(yǎng)6 d后,利用十字交叉法測量指狀青霉生長的縱徑和橫徑,并用以下公式計算抑制率(%)。

式中:I為抑制率,%;l0為平皿直徑,cm;l為菌落直徑,cm。

1.2.4 輻照對指狀青霉菌絲細(xì)胞膜滲透性的影響 在超凈工作臺中,加入1 mL菌懸液于100 mL PDB培養(yǎng)基中得稀釋菌懸液,置于28 ℃恒溫?fù)u床振蕩(160 r/min)培養(yǎng)2 d后進(jìn)行輻照處理。輻照后立即取5 mL稀釋菌懸液在超速離心機(jī)中離心(10000 r/min,15 min),取上清液用電導(dǎo)儀測電導(dǎo)率R0;剩下的繼續(xù)搖床培養(yǎng),并于1、2、3、4、5 h后取5 mL稀釋菌懸液,離心測上清液電導(dǎo)率Ri(i=1,2,3,4,5),用以下公式計算相對電導(dǎo)率R(%)。

1.2.5 輻照對指狀青霉菌絲的總糖含量的影響 在超凈工作臺中,加入1 mL菌懸液于100 mL PDB培養(yǎng)基中得稀釋菌懸液,置于28 ℃恒溫?fù)u床振蕩(160 r/min)培養(yǎng)5 d。輻照后繼續(xù)搖床培養(yǎng)2 d后測定菌絲總糖含量[32],總糖測定采用蒽酮比色法,獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.2342x-0.055(y為糖質(zhì)量，μg；x為吸光度),R2=0.9938。計算樣品中總糖含量:

式中:S為總糖含量,%;C為蒽酮標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的糖量,μg;D為稀釋倍數(shù);V1為提取液體積,mL;V2為測定時取用體積,mL;W為組織重量,g;106為樣品重量單位換算常數(shù),由g換算成μg。

1.2.6 輻照對指狀青霉可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 樣品處理過程同1.2.1,采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白質(zhì)含量[33]。

1.2.7 輻照對指狀青霉菌絲蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性大小的影響 蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性測定依據(jù)測試盒進(jìn)行,樣品處理過程同1.2.1。

1.2.8 椪柑保鮮處理及指標(biāo)檢測 挑選著色均勻、大小適中、果形端正、無病蟲斑以及無機(jī)械損傷的椪柑果實,分為五組,其中四組分別用強(qiáng)度為0.25、0.50、0.75、1.00 kGy的γ-射線輻照,另外一組為空白對照。輻照完成后,將處理組與空白對照組一同放置在常溫下貯藏,每隔5 d進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。

1.2.8.1 椪柑果實失重率的測定 采用稱量法進(jìn)行椪柑果實失重率的測定。首先稱量輻照前椪柑質(zhì)量,然后每隔5 d稱量輻照后椪柑質(zhì)量,并通過以下公式計算椪柑在各時間段的失重率。

式中:S為失重率,%;m1為果實質(zhì)量差,g;m2為果實質(zhì)量,g。

1.2.8.2 椪柑果實呼吸強(qiáng)度的測定 采用紅外分析儀進(jìn)行呼吸強(qiáng)度的測定即用紅外分析儀測定單位時間單位體積內(nèi)讀數(shù)的變化便為CO2的讀數(shù)變化[34]。呼吸強(qiáng)度計算公式:

式中:R為呼吸強(qiáng)度,mg/(kg·h);C1為CO2起始濃度,mg/m3;C2為CO2終止?jié)舛?mg/m3;V為玻璃干燥器體積,L;m為果實重量,g;t為測定時間,h。

1.2.8.3 椪柑果實可溶性固形物的測定 利用手持式折光儀測定[33]。

1.2.8.4 椪柑果實有機(jī)酸含量的測定 測定方法參照文獻(xiàn)[33]。計算公式如下:

式中:S為有機(jī)酸含量,%;V為提取液總體積,mL;c為氫氧化鈉滴定液濃度,mol/L;V1為滴定濾液消耗的氫氧化鈉溶液體積,mL;V0為滴定蒸餾水消耗的氫氧化鈉溶液體積,mL;f為折算系數(shù),g/mmol;Vs為滴定時所取濾液體積,mL;m為樣品質(zhì)量,g。

1.2.8.5 椪柑果實抗壞血酸含量的測定 測定方法參照文獻(xiàn)[33]。計算公式如下:

式中:R為抗壞血酸含量,mg/100 g;V為樣品提取液總體積,mL;V1為滴定濾液消耗的染料體積,mL;V0為空白滴定消耗的染料體積,mL;ρ為1 mL染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸的質(zhì)量,mg/mL;Vs為滴定時所取樣品溶液體積,mL;m為樣品質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件進(jìn)行制圖,并使用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-輻照對指狀青霉生長的影響

圖1為經(jīng)γ-射線輻照后指狀青霉的生長情況。從圖1A和圖1B可以看出,隨著輻照強(qiáng)度的逐漸增大,指狀青霉菌落直徑逐漸減小,抑制率逐漸增加,各個輻照處理組的抑制率均顯著高于對照(p<0.05)。尤其是當(dāng)輻照強(qiáng)度為1.00 kGy時,其抑制率達(dá)到90%,如圖1B所示。這表明,在一定的輻照強(qiáng)度范圍內(nèi),γ-射線輻照能有效抑制指狀青霉的生長,并且輻照強(qiáng)度越大,抑菌效果越佳。

圖1 γ-輻照對指狀青霉生長的影響Fig.1 Effects of γ-irradiation on the growth of Penicillium digitatum注:不同小寫字母代表差異顯著,p<0.05;圖3～圖4同。

2.2 γ-輻照對指狀青霉菌絲細(xì)胞膜滲透性的影響

細(xì)胞膜作為菌絲體的保護(hù)屏障,對菌絲的正常生長起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時,內(nèi)部電解質(zhì)外泄,導(dǎo)致溶液電導(dǎo)率上升,故而培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)胞膜滲透性的變化[35]。由圖2可以看出,在一定強(qiáng)度的輻照范圍內(nèi),隨著輻照強(qiáng)度的增大以及輻照時間的延長,指狀青霉培養(yǎng)液的相對電導(dǎo)率逐漸增大。并且四個輻照處理組的相對電導(dǎo)率均高于空白對照組,差異明顯。這表明用一定強(qiáng)度的γ-射線輻照指狀青霉,會使菌絲細(xì)胞膜破損,導(dǎo)致菌絲體內(nèi)的內(nèi)含物外滲至培養(yǎng)液中,使得培養(yǎng)液的相對電導(dǎo)率增大,并且輻照強(qiáng)度越大,對菌絲細(xì)胞膜的破壞越嚴(yán)重。

圖2 γ-輻照對指狀青霉菌絲細(xì)胞膜滲透性的影響Fig.2 Effects of γ-irradiation on cell membrane permeability of Penicillium digitatum

2.3 γ-輻照對指狀青霉菌絲總糖和可溶性蛋白含量的影響

可溶性糖、蛋白質(zhì)以及核酸貫穿整個細(xì)胞內(nèi)部,它們的釋放表明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損,膜滲透性加大[36-37]。由圖3可以看出,經(jīng)不同強(qiáng)度輻照過的指狀青霉,其菌絲體內(nèi)的總糖與可溶性蛋白含量均顯著(p<0.05)低于空白對照組。這表明在一定的輻照強(qiáng)度范圍內(nèi),經(jīng)過輻照的指狀青霉,其菌絲體細(xì)胞膜受到破壞,滲透性增大,致使該菌絲體的內(nèi)含物大量外泄,最終導(dǎo)致菌絲體本身所含總糖與可溶性蛋白含量減少。

圖3 γ-輻照對指狀青霉菌絲總糖(A)和可溶性蛋白含量(B)的影響Fig.3 Effects of γ-irradiation on total sugar(A) and soluble protein(B)content of Penicillium digitatum

2.4 γ-輻照對指狀青霉菌絲蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性的影響

蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)是TCA循環(huán)中重要的氧化還原酶。MDH是糖代謝關(guān)鍵酶之一,該酶活性大小可作為衡量糖代謝的指標(biāo)。SDH是線粒體功能反映的標(biāo)志酶之一,該酶活性常作為TCA循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)[38]。由圖4可以看出,經(jīng)不同強(qiáng)度γ-射線輻照過的指狀青霉,其菌絲體的蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性相比于對照均顯著降低(p<0.05),并且輻照強(qiáng)度越大,酶的活性越低。這兩種脫氫酶均是三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶,與菌絲體正常能量代謝有關(guān),經(jīng)過輻照后其活性大幅度下降,因此最終導(dǎo)致菌絲體細(xì)胞的生長受到嚴(yán)重影響。

圖4 γ-輻照對指狀青霉菌絲蘋果酸脫氫酶(A)和琥珀酸脫氫酶(B)活性的影響Fig.4 Effects of γ-irradiation on the activity of malate dehydrogenase(A)and succinate dehydrogenase(B)of Penicillium digitatum

2.5 γ-輻照對椪柑果實保鮮效果的影響

2.5.1γ-輻照對椪柑果實失重率的影響 果實的失重率是判斷保鮮效果的重要表觀指標(biāo)之一。經(jīng)不同強(qiáng)度的γ-輻照處理的椪柑果實失重率如圖5所示。通過對比發(fā)現(xiàn),0.25、0.50 kGy的輻照對果實失重率影響并不明顯,與對照相比無明顯差異。而當(dāng)輻照強(qiáng)度為0.75、1.00 kGy時,果實失重率高于對照組。這可能是過高的輻射強(qiáng)度對果實有一定傷害,造成表皮損傷,導(dǎo)致失重率相對過高。

圖5 不同強(qiáng)度γ-輻照對椪柑果實失重率的影響Fig.5 Effects of different dose γ-irradiation on weight loss rate of Ponkan fruit

2.5.2γ-輻照對椪柑果實呼吸強(qiáng)度的影響 呼吸作用是園藝產(chǎn)品采后生理代謝的最主要過程,隨著呼吸作用的進(jìn)行,果實中的糖類等營養(yǎng)物質(zhì)的不斷被消耗,造成貯藏期果實品質(zhì)不斷下降。故而貯藏期果實的呼吸強(qiáng)度可直觀的反映果實的生理代謝狀況[39]。從圖6可以看出,經(jīng)不同強(qiáng)度γ-輻照處理以及對照果實的呼吸強(qiáng)度在貯藏期間總體上均呈下降趨勢,這說明椪柑是典型的非躍變型果實。從圖6中還可以看出,輻照處理可以明顯刺激呼吸強(qiáng)度的增加,在貯藏剛開始的時候,各個輻照處理組果實的呼吸強(qiáng)度均高于對照組,但從第5 d以后,0.25、0.50 kGy兩個處理組的呼吸強(qiáng)度和對照差異不明顯。此外,0.75、1.00 kGy兩個處理組的果實呼吸強(qiáng)度在整個貯藏前期(0～15 d)高于對照和其它各組,這可能由于是過高的輻照強(qiáng)度對果實造成傷害產(chǎn)生的傷呼吸所致。

圖6 不同強(qiáng)度γ-輻照對椪柑果實呼吸強(qiáng)度的影響Fig.6 Effects of different dose γ-irradiation on respiration intensity of Ponkan fruit

2.5.3γ-輻照對椪柑果實品質(zhì)的影響 有機(jī)酸、可溶性固形物及抗壞血酸均是果實營養(yǎng)物質(zhì),因此它們的含量可以直接反應(yīng)果實的品質(zhì)。從圖7A可以看出,各處理以及對照椪柑果實在整個貯藏期間有機(jī)酸(TA)含量整體呈下降趨勢,這與萬春鵬等[39]的研究結(jié)果一致，主要是有機(jī)酸可以作為呼吸底物被消耗從而導(dǎo)致其含量隨著貯藏時間的延長不斷下降。在各個輻照處理組中,其中0.5 kGy輻照組的果實TA含量貯藏20 d明顯高于對照組。這表明0.50 kGy的γ-輻照能有效延緩椪柑果實TA含量下降,使果實保持良好的品質(zhì)。而1.00 kGy輻照組的果實TA含量甚至低于空白對照組,說明輻照強(qiáng)度過高導(dǎo)致果實代謝異常。

各處理以及對照組椪柑果實可溶性固形物含量的變化如圖7B所示,所有處理組果實的可溶性固形物含量在整個貯藏期間除對照組外呈先上升再下降的趨勢,這可能是由于在貯藏前期果實內(nèi)多糖的水解過程占優(yōu)勢導(dǎo)致可溶性糖增加,貯藏中后期隨著呼吸作用的不斷消耗而導(dǎo)致可溶性固形物含量不斷降低。其中0.50 kGy輻照組的果實在貯藏中后期可溶性固形物含量高于1.00 kGy輻照組和對照組。

從圖7C可以看出,在整個貯藏期間,椪柑果實的抗壞血酸含量整體上呈先上升后下降的趨勢。到貯藏中后期0.50 kGy輻照組的果實抗壞血酸含量最高,但各處理組與對照組之間差異不明顯。因此,γ-輻照可以減緩椪柑果實有機(jī)酸、可溶性固形物及抗壞血酸的損失,保留更多的營養(yǎng)物質(zhì),從而保證椪柑品質(zhì)。其中0.50 kGy輻照處理效果最佳。

圖7 不同強(qiáng)度γ-輻照對椪柑品質(zhì)的影響Fig.7 Effects of different dose γ-irradiation on quality of Ponkan fruit

3 討論與結(jié)論

輻照作為一種處理手段,目前的研究集中在對真菌病原體生長的影響上[40]。據(jù)相關(guān)報道,輻照可有效抑制果實產(chǎn)品上的真菌群生長[41]。通過測量指狀青霉經(jīng)輻照后菌餅的大小表明,γ-輻照對指狀青霉具有較強(qiáng)抑制作用,且在本研究的輻照強(qiáng)度范圍內(nèi),抑制效果和輻照強(qiáng)度呈正相關(guān),當(dāng)輻照強(qiáng)度從0.25 kGy升高至1.00 kGy時,抑制率從20%升高至90%,這與王超等[42]在研究γ-輻照對低溫火腿產(chǎn)品中初始微生物數(shù)量影響時獲得的研究結(jié)果一致,即隨著輻照強(qiáng)度的增加,產(chǎn)品中微生物數(shù)量顯著減少。當(dāng)輻照作用于病原菌菌絲體時,菌絲體的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜滲透性增加,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞,導(dǎo)致胞內(nèi)的內(nèi)含物大量外泄,且輻照強(qiáng)度越大,作用越強(qiáng),內(nèi)含物外泄越嚴(yán)重,培養(yǎng)液的電導(dǎo)率越大,可溶性蛋白和總糖含量越低,當(dāng)輻照強(qiáng)度從0.25升至1.00 kGy時,其總糖含量從0.26%降至0.04%,可溶性蛋白含量從0.12降至0.04 μg/g,彭旋等[32]在研究白薇提取液對意大利青霉菌絲細(xì)胞膜滲透性以及菌絲體可溶性蛋白和總糖含量的影響中也得到了一致的結(jié)果。本研究探討了γ-輻照對指狀青霉菌絲體蘋果酸脫氫酶與琥珀酸脫氫酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)經(jīng)γ-輻照處理的指狀青霉,其蘋果酸脫氫酶與琥珀酸脫氫酶活性均有不同程度的降低,且輻照強(qiáng)度越大,兩種酶活性越低,當(dāng)輻照強(qiáng)度從0.25升至1.00 kGy時,其蘋果酸脫氫酶活性從1.10降至0.35 U,琥珀酸脫氫酶活性從30.50降至4.00 U,降低了該菌絲體的能量代謝水平,從而影響其正常生長。

通過對椪柑果實的保鮮試驗發(fā)現(xiàn),利用一定強(qiáng)度的γ-輻照處理椪柑果實可以延緩其有機(jī)酸、可溶性固形物以及抗壞血酸的降解,減少椪柑中營養(yǎng)物質(zhì)的流失。但對果實失重率和呼吸強(qiáng)度的影響不明顯。且過高強(qiáng)度的γ-輻照會對果實造成一定的傷害,導(dǎo)致其代謝異常,果皮表面出現(xiàn)褐色斑點。因此,利用γ-輻照對柑橘類果實保鮮一定要控制好輻照強(qiáng)度。

綜上所述,一定強(qiáng)度的γ-輻照能夠通過破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、影響相關(guān)酶的活性的方式來抑制指狀青霉的生長,同時適宜強(qiáng)度的γ-輻照對椪柑果實具有一定的保鮮效果,是一種具有應(yīng)用前景的優(yōu)良保鮮技術(shù)。