田程飄,朱偉偉,宋雅玲,牛思琪,申利群,2,*,吳愛群,*

(1.廣西民族大學化學化工學院,廣西南寧 530006;2.廣西林產化學與工程重點實驗室,廣西南寧 530006)

生姜(ZingiberofficinaleRose)是姜科屬多年生單子葉草本植物的根莖,作為特產經濟作物在我國的中部、東南部至西南各省廣為栽培,數(shù)千年以來一直被廣泛用于日常生活中,并且在傳統(tǒng)醫(yī)學中也被大量使用了幾百年[1]。近年來,由于具有眾多重要的藥理作用,生姜受到食品和制藥行業(yè)的關注日益增加。生姜中所含的多種活性成分如黃酮類、姜黃素、姜辣素等具有開胃健脾、抗氧化、殺菌、抑制腫瘤等多種活性[2]。在民間,人們常采用醋泡的方法對生姜進行炮制后食用,口感更為美味可口[3]。根據(jù)中醫(yī)理論,醋泡姜具有保護胃、抗炎、暖肺等功效,可減少水痰,控制嘔吐,抗酸,抑菌[4-5],它可用于治療感冒、減肥。養(yǎng)肝也是醋泡姜的重要作用之一,中醫(yī)講究五味配五臟,酸配肝,醋[6]就是一種酸性食材,它有養(yǎng)肝補肝的作用,而生姜性熱,它能溫補肝陽,平時人們食用醋泡姜時,酸辣適中,對食管和胃沒有什么明顯傷害,且可以提高肝功能。諸多的保健作用和極佳口感使得醋泡生姜已作為一種倍受認可的功能食品廣為流傳。目前對生姜的研究報道很多,但對醋泡后的生姜研究甚少[3],關洪全等[4]研究生姜與醋酸協(xié)同抗菌作用,發(fā)現(xiàn)生姜與較低濃度的醋酸組合后,對抗菌活性表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。

為更好地開發(fā)利用醋泡生姜這一功能食品。本研究測定醋泡生姜提取物的DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基(·OH)清除率及總還原力,對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和白色念珠菌的抗菌活性以及對人結腸癌細胞、人肝癌細胞、卵巢癌細胞的抗腫瘤活性,為進一步研究利用生姜提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜的鮮根莖 廣西南寧市羅文市場;75%乙醇、無水乙醇 國藥集團;冰乙酸 成都科隆;抗壞血酸(VC)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等 均為國產分析純;細菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶EDTA消化液、磷酸鹽緩沖液 生化試劑;供試真菌和細菌 北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司;人結腸癌細胞(human colon cancer cell,HCT116) 上海中喬新舟生物科技有限公司;人肝癌細胞(human liver cancer cell,HepG2) 溫州醫(yī)科大學;卵巢癌細胞(ovarian carcinoma cells,Skov3) 廣西醫(yī)科大學。

GO全波長酶標儀 Thermo Multiskan Go(Thermo Lab systems公司);生化培養(yǎng)箱 江蘇華安設備有限公司;YXQ-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司;KA-1000低速離心機 上海安亭科學儀器廠;3111 5% CO2及飽和濕度孵化箱 美國Thermo Fisher scientific公司;SW-CJ-1F超凈臺 江蘇蘇凈;96孔培養(yǎng)板 蘇州海貍。

1.2 供試樣品的制備

取新鮮生姜洗凈,晾干表面水分,切成薄片(厚度為0.2～0.4 cm)[7],稱取500 g,參考市售食醋含乙酸約為3%,用350 mL 3%冰乙酸剛好沒過生姜進行醋泡,室溫25 ℃下密封放置7d。濾出生姜放入磨口圓底燒瓶中,加蒸餾水至沒過生姜,用揮發(fā)油提取裝置,進行6 h的水蒸汽蒸餾提取得到揮發(fā)油。濾去水后加入75%乙醇[8-10]300 mL,85 ℃水浴回流1 h,減壓回收濾液后得到醋泡生姜乙醇提取浸膏。另未醋泡的生姜進行同樣提取,得生姜揮發(fā)油和生姜乙醇提取浸膏。

1.3 指標測定方法

1.3.1 抗氧化活性測定

1.3.1.1 對DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻[11],稍作修改,即配制系列濃度各樣品溶液(生姜油和醋泡姜姜油0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL,生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/mL,抗壞血酸0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050 mg/mL),1 mmol/L DPPH乙醇溶液。取96孔板,每孔加入150 μL DPPH乙醇溶液和樣品溶液50 μL,振蕩混勻后,室溫避光放置30 min,于517 nm波長處測定吸光度,記為A1;以150 μL無水乙醇代替DPPH,同法測定吸光度,記為A2,以樣品溶劑代替樣品,同法測定吸光度,記為A0。以抗壞血酸溶液作為陽性對照,測定DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

1.3.1.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參照文獻[12],稍作改變,配制系列濃度各樣品溶液(生姜油和醋泡姜姜油0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL,生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.50 mg/mL,抗壞血酸0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040 mg/mL),取7 mmol/L的ABTS+與1.4 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合均勻,避光放置16 h,臨用前用蒸餾水稀釋至吸光度為0.7±0.02,得ABTS工作液。取工作液150 μL、樣品溶液50 μL,置于96孔板孔中,反應6 min后于734 nm波長處測定吸光度,記為A1;以溶劑代替樣品,同法測定吸光度,記為A0;以150 μL去離子水代替ABTS,同法測得各樣品對照組的吸光度,記為A2。以抗壞血酸為陽性對照品,測定ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

1.3.1.3 對羥自由基(·OH)清除能力的測定 利用Fenton反應[13-14],在100 μL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液中依次加入100 μL 9 mmol/mL 硫酸亞鐵和1 mg/mL的樣品提取物或0.2 mg/mL的抗壞血酸溶液(100、200、300、400、500、600和700 μL,生姜各樣品在體系中濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL,抗壞血酸0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL),接著補充去離子水至1.4 mL,最后加入100 μL 8 mmol/L的H2O2啟動反應,37 ℃水浴反應15 min后于510 nm處測吸光度A1,以去離子水替代樣品同法測得A0,以去離子水代替H2O2測得各樣品的對照A2。以抗壞血酸為對照,測定羥自由基(·OH)清除率。

·OH清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

1.3.1.4 還原能力的測定 配制系列樣品溶液生姜油和醋泡姜姜油0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL,生姜乙醇提取物和醋泡生姜乙醇提取物0.03、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00 mg/mL,抗壞血酸0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL),參照文獻[15]配制各反應試劑,在EP管中加入500 μL pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液,200 μL樣品溶液,500 μL 1%鐵氰化鉀立刻混勻后于50 ℃反應20 min,取出加入500 μL 10%三氯乙酸,混勻反應10 min,取出500 μL,加入500 μL H2O,100 μL 0.1%三氯化鐵溶液,靜置10 min,于700 nm波長處測定吸光度。以抗壞血酸為陽性對照品,測定各吸光度,用于表示還原能力的強度。

1.3.2 抑菌活性的測定 通過采用微量肉湯稀釋法來測定生姜提取物的最低抑菌濃度(MIC)[16]。采用微量二倍稀釋法,在聚乙烯96孔板上進行:96孔板上每兩行作為一個樣品的平行試驗,從A1開始為第一孔,從左到右,從上到下;每個板上1～11孔為樣品,第12孔為培養(yǎng)基空白對照,每板留三孔加培養(yǎng)基和供試菌各100 μL作為驗證,每個板只能加一種菌;大腸桿菌(G-),金黃色葡萄球菌(G+),枯草芽孢桿菌(G+)用LA肉湯培養(yǎng)基,肺炎克雷伯氏菌(G-)用MHA培養(yǎng)基,白色念珠菌用PDA培養(yǎng)基。用微量加液器加液,第2～11孔每孔加含2% DMSO的無菌培養(yǎng)基100 μL,往1號孔和2號孔中加入100 μL已配好的母液,依次對第1～11孔做梯度稀釋。在每孔中加入100 μL的檢驗菌菌液,每孔菌數(shù)為5×104個。在1～11孔的樣品最終濃度分別生姜乙醇提物和醋泡姜乙醇提物:1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9063、1.9531和0.9766 μg/mL;生姜油和醋泡姜姜油:5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77和4.89 μg/mL。檢驗菌為金黃葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌等的置于37 ℃培養(yǎng)24 h,白色念珠菌的放30℃。培養(yǎng)結束后,比較檢測組與空白對照組渾濁度差異,無可見細菌生長即液體相對澄清且無沉淀的孔內所含的藥物濃度即為最低抑菌濃度(MIC值)。

1.3.3 抗腫瘤活性測定 將凍存的HCT116、HepG2和Skov3細胞取出在38 ℃水浴加熱,1 min內使其完全融化,加入到培養(yǎng)基混勻離心棄去上清液,加入適量培養(yǎng)基后接種于細胞瓶置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)細胞生長到對數(shù)期后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細胞,細胞密度控制在1×105個·mL-1左右細胞懸液,以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL。置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,觀察細胞大概長滿96孔板的80%～90%即可上藥。處理細胞:按試驗設計共分4組,分別為生姜油、醋泡姜油、生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物用藥組。吸去孔內培養(yǎng)基后用藥組加入濃度為200、100、50、25、12.5 μg·mL-1的各提取物溶液;同時設定調零孔,每組5個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。呈色:培養(yǎng)48 h后取出培養(yǎng)板,吸去上清液,每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg·mL-1),37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,小心吸去孔內的培養(yǎng)上清液。每孔再加入100 μL二甲亞砜(DMSO),振蕩10 min,使結晶物充分溶解。比色:選擇490 nm波長,在自動酶標儀上測定各孔吸光度(A)值。細胞抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100,其中,As:實驗孔,含有細胞的培養(yǎng)基,MTT,藥物;Ac:對照孔,含有細胞的培養(yǎng)基,MTT,沒有加藥的培養(yǎng)基;Ab:空白孔,不含細胞和藥物的培養(yǎng)基,MTT[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實驗均重復進行3次。抗氧化實驗數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件計算平均值和標準差,Origin Pro 9作圖,計算IC50;抗腫瘤實驗數(shù)據(jù)表示為Mean±SD,采用Graphpad prism 6.0軟件計算出IC50值,用Excel 2010軟件計算平均值和標準差。

2 結果與分析

2.1 抗氧化活性測定結果

2.1.1 姜提取物對DPPH自由基的清除作用 由圖1可看出生姜油和醋泡姜姜油對DPPH自由基的清除率在0.4～6 mg/mL的范圍內與濃度成正相關。隨樣品濃度的增加,生姜油對DPPH自由基的清除率由19.89%上升至59.68%,醋泡姜姜油對DPPH自由基的清除率由20%上升至56.24%,兩者相差不大(IC50分別為4.67和4.9 mg/mL)。生姜乙醇提取物在0.1～0.8 mg/mL的范圍內隨濃度的增加,清除率由35.8%上升至52%,而后趨于平緩而不變,IC50為0.67 mg/mL,與夏樹林等[18]的研究結果相符(IC50為0.8 mg/mL,且高于此濃度后,清除率趨于平緩),弱于唐仕榮等[19]的研究的研究結果(IC50為0.076 mg/mL);醋泡姜乙醇提取物在0.1～2 mg/mL之間隨濃度的增加,對DPPH自由基的清除率為增強趨勢,清除率由27.41%上升至60.12%,隨后亦趨于平緩,IC50為1.25 mg/mL;最終在2、4 mg/mL濃度下醋泡姜乙醇提取物較生姜乙醇提取物清除DPPH自由基效果均好一些。而抗壞血酸在0.005～0.05 mg/mL的范圍內,清除率由24.24%上升至83%,IC50為0.018 mg/mL。綜上,對于清除DPPH自由基活性的效果,抗壞血酸?生姜乙醇提取物>醋泡姜乙醇提取物>生姜油≈醋泡姜姜油。

圖1 樣品濃度對DPPH自由基清除效果的影響Fig.1 Effects of samples concentrations on DPPH free radical scavenging ability

2.1.2 姜提取物對ABTS+自由基的清除作用 由圖2所示,隨著樣品濃度的增加,其對ABTS+自由基的清除率均呈上升趨勢,清除率與樣品濃度成正相關。其中,生姜油在0.05～1 mg/mL的范圍內隨濃度的增加,對ABTS+自由基的清除率由10.38%上升至70.08%;而醋泡姜姜油的清除率則由14.07%上升至71.179%。比較得出醋泡姜姜油(IC50為0.52 mg/mL)對ABTS+自由基的清除能力略強于生姜油(IC50為0.59 mg/mL)。生姜乙醇提取物在0.05～0.25 mg/mL之間隨濃度的增加,對ABTS+自由基的清除率明顯增強,清除率由34.78%上升至90.16%,而后變緩,最終為90.81%;醋泡姜乙醇提取物在0.05～0.25 mg/mL之間隨濃度的增加,對ABTS+自由基的清除率明顯增強。清除率由34.66%上升至88.19%,而后變緩,最終為90.62%;兩個乙醇提取物對ABTS+自由基的清除能力差異不明顯(IC50分別為0.07和0.08 mg/mL)。綜合得出,四種提取物清除ABTS+自由基能力:抗壞血酸>生姜乙醇提取物≈醋泡姜乙醇提取物>醋泡姜姜油>生姜油。

圖2 樣品濃度對ABTS+自由基清除效果的影響Fig.2 Effects of samples concentrations on ABTS+ free radical scavenging ability

2.1.3 姜提取物對羥自由基(·OH)的清除作用 由圖3可知,醋泡姜姜油對羥自由基(·OH)的清除作用明顯優(yōu)于生姜油,在0.1～0.7 mg/mL的濃度范圍內,清除率由23.76%上升至92.2%,IC50為0.28 mg/mL,而生姜油在相同的最大濃度下僅是達到81.67%,且其IC50為0.42 mg/mL,弱于醋泡姜姜油。兩個乙醇提取物的清除作用較弱,在相同濃度下,生姜乙醇提取物的清除率由13.81%上升至54.7%;醋泡姜乙醇提取物的清除率則由15.04%上升至50.58%,上升趨勢較緩慢;比較得出兩個乙醇提取物清除羥自由基(·OH)效果相差不顯著(IC50分別為0.65和0.69 mg/mL)?？箟难嵩?.02～0.14 mg/mL的濃度范圍內,清除率由14.36%上升至100%,IC50為0.07 mg/mL。綜上可知,對于羥自由基(·OH)的清除作用抗壞血酸>醋泡姜姜油>生姜油>生姜乙醇提取物≈醋泡姜乙醇提取物。

圖3 樣品濃度對羥自由基(·OH)清除效果的影響Fig.3 Effects of samples concentrations on hydroxyl free radical scavenging ability

2.1.4 姜提取物還原力的測定 由圖4可知,在一定濃度范圍內,隨樣品濃度的升高,總還原力呈上升趨勢。其中,生姜油在0.8～6 mg/mL的范圍內,吸光度由0.129上升至0.327;在相同濃度下,醋泡姜姜油吸光度由0.128上升至0.391;由此得出,一定濃度范圍內,醋泡姜姜油的還原力強度優(yōu)于生姜油。生姜乙醇提取物總還原力在0.03～1 mg/mL的范圍內與濃度成正相關,但0.03～0.3 mg/mL變化較緩,0.5～1 mg/mL急劇上升,吸光度由0.121上升至0.204,1 mg/mL時為0.421;醋泡姜姜乙醇提取物在0.03～1 mg/mL濃度區(qū)間內,吸光度由0.117上升至0.447。綜上可知,醋姜油和醋姜乙醇提取物還原力的強度優(yōu)于生姜油與生姜乙醇提取物,但均差于抗壞血酸。

圖4 樣品濃度對總還原力的影響Fig.4 Effects of samples concentrations on total reducing power

2.2 姜提取物對各供試菌的MIC

生姜提取物對各供試菌的最低抑菌濃度見表1～表4。由此可知,生姜提取物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和肺炎克雷伯氏菌抑菌濃度各不相同,最低抑菌濃度(MIC)分別為156.25、500、250 μg/mL。隨著提取物濃度的增加,其抑菌活性也逐漸增強。四種樣品中,對金黃色葡萄球菌抑制效果最好的是醋泡姜姜油,MIC為156.25 μg/mL,而乙醇提取物的均為1000 μg/mL,對枯草芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌抑制效果最好的為生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物,MIC分別為500和250 μg/mL,高于李鐘美[20]的研究結果,可能是其所用樣品為溶劑提取混合物,而本研究的提取分成了揮發(fā)油和樹脂兩部分?？梢娚崛∥锱c醋泡姜提取物均具有一定的抑菌作用。醋泡姜姜油對金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的抑制作用均優(yōu)于生姜油,推測醋酸作用于生姜對抑菌效果起到了一定的協(xié)同作用,即醋泡可在一定程度上增強生姜的抑菌效果。

表1 生姜油對不同細菌生長的抑制情況Table1 Inhibition of growth of different bacteria by ginger oil

表2 醋泡姜姜油對不同細菌生長的抑制情況Table 2 Inhibition of growth of different bacteria by vinegar ginger oil

表3 生姜乙醇提取物對不同細菌生長的抑制情況Table 3 Inhibition of growth of different bacteria by ginger ethanol extract

表4 醋泡姜乙醇提取物對不同細菌生長的抑制情況Table 4 Inhibition of growth of different bacteria by vinegar ethanol extract

2.3 MTT法檢測出姜提取物對腫瘤細胞的增殖抑制作用

采用MTT法檢測四個姜提取物對HCT116、HepG2和Skov3三種人腫瘤細胞的增殖抑制作用,結果如表5所示,各個姜提取物對HCT116、HepG2和Skov3都有一定的增殖抑制作用。作用24 h時,觀察到抑制作用仍不明顯,孔內液體仍帶培養(yǎng)基原來的淺紫色,說明用藥組尚未開始起作用,推測可能是樣品為混合物,其主要抗腫瘤成分含量相對較少的原因。作用48h后呈色,96孔板上顏色呈梯度,藥物濃度越大的顏色越淺,原因是藥物濃度大抑制作用強,存活細胞少,其代謝物少而與MTT呈色淺。其中在HCT116的增殖抑制作用實驗中,生姜乙醇提取物的效果最為突出[(49.4±1.42) μg/mL],Gan等[21]在研究人結腸癌細胞HCT116中發(fā)現(xiàn),6-姜烯酚透過下調細胞周期蛋白cyclinB、cdc25C、cdkl和紡錘體裝配蛋白cdc20、mad2和survivin的表達,造成G2/M期周期阻滯的不可逆轉,促使細胞死亡;姜油、醋泡姜姜油、生姜乙醇提取物、醋泡姜乙醇提取物四個樣品對Skov3的抑制效果較好,其IC50分別為(38.37±0.66)、(39.90±1.37)、(48.18±1.3)和(48.79±1.24) μg/mL。即醋泡生姜和生姜對卵巢癌(Skov3)細胞有一定的抑制作用。

表5 四種姜提取物對HCT116、HepG2和Skov3的IC50(μg/mL)Table 5 IC50 of four ginger extracts to HCT116,HepG2 and Skov3 cells(μg/mL)

3 結論

本研究比較分析了生姜與醋泡姜的抗氧化、抑菌與抗腫瘤活性其中,醋泡姜姜油的清除ABTS+自由基、羥自由基(·OH)能力和還原能力均強于生姜油,生姜乙醇提取物與醋泡姜乙醇提取物抗氧化能力相差不顯著,總體上其乙醇提取物的抗氧化效果稍優(yōu)于其揮發(fā)油。

在微量肉湯稀釋法評價四個生姜提取物的抑菌實驗中,抑菌效果最佳的是醋泡姜姜油,其對金黃色葡萄球菌的MIC為156.25 μg/mL,其次是兩個乙醇提取物對枯草芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌抑制效果,MIC分別為500和250 μg/mL;實驗表明四個生姜樣品均具有較強的抑菌效果,醋泡姜姜油對金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的增殖抑制作用均明顯強于生姜油,推測是醋泡對生姜抑菌成分產生了影響。在MTT法測定生姜提取物對HCT116、HepG2和Skov3三個腫瘤細胞的試驗中,四個姜提取物均體現(xiàn)出一定的增殖抑制作用,以生姜乙醇提取物對HCT116的增殖抑制作用最為突出[(49.4±1.42) μg/mL],四種姜提取物對Skov3均有良好的抑制效果,此結果可以為醋泡生姜的研究開發(fā)提供一定的參考。