周曉晴,胡立文,羅 琦,曾林暉,李 晴,蘭 偉

(1.江西省食品檢驗檢測研究院,江西南昌,330001;2.南昌大學食品學院,江西南昌,330000;3.江西省產品質量監(jiān)督檢測院,江西南昌,330000)

茶葉籽油是以茶葉樹(CamelliaSinensisO.Ktze.)的果實茶葉籽為原料,經物理壓榨或溶劑浸出而得的食用油脂,富含不飽和脂肪酸[1]。世界各茶葉產地均對茶葉籽油進行研究和開發(fā)[2-4],中國衛(wèi)生部2009年第18號文件批準茶葉籽油為新資源食品。

茶多酚是以茶葉為原料提取的多酚混合物,由黃酮、黃烷酮、酚酸、花青素等組成,其中兒茶素占60%～80%,兒茶素類有八種結構,分別是兒茶素(catechin,+C)、表兒茶素(epicatechin,-EC)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate,-GC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin,-ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,-EGC)、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,-EGCG)、沒食子兒茶素(gallocatechin,+GC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,-GCG),其中-GC、-ECG、-EGCG和-GCG具有酯鍵結構可微溶于油脂[5]。茶多酚可清除自由基,具有抗氧化作用[6]。有研究表明茶多酚可抗結腸癌[7]。

茶多酚中部分成分可微溶于油脂。有報道在橄欖油和油茶(CamelliaoleiferaAbel.)油中測得兒茶素[8-9];梁杏秋等[10]認為茶多酚酯型化合物以穩(wěn)定狀態(tài)分散地存在于茶葉籽油中。朱晉萱等[11-12]參照GB/T 8313-2018中福林酚法測定了13個省的茶葉籽油中茶多酚含量,以EGCG為標準物,測得茶多酚含量為19.73～47.61 mg·kg-1。Fazel等[13]以高效液相色譜法(HPLC)測得伊朗地區(qū)茶葉籽油中+C、-EC、-ECG、-EGC、-EGCG、+GC和-GCG 7種兒茶素的含量,其中-GC未檢出;Wang等[14]以高效液相色譜-質譜聯用測得中國多個產地的茶油、紅花茶油和茶葉籽油中苯甲酸、肉桂酸、羥基苯乙酸、黃烷醇、黃酮醇、黃酮類化合物和二氫黃酮類化合物含量,其中茶葉籽油兒茶素總含量為2.25～3.31 mg·kg-1。上述文獻報道福林酚法測得茶葉籽油中茶多酚含量,按占比60%～80%換算成兒茶素,與HPLC法測得茶葉籽油中兒茶素類總含量相差較大。

本文參照GB/T 31740.2-2015茶制品中茶多酚和兒茶素測定方法,分別對茶葉籽壓榨毛油、浸出毛油、粗脂肪和茶葉籽精煉油中茶多酚和兒茶素類進行測定,并進行分析對比,探討福林酚法測定茶葉籽油中茶多酚含量和HPLC法測定茶葉籽油中兒茶素總含量的合理性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉籽 采摘自江西萍鄉(xiāng)、興國和婺源;茶葉籽毛油及精煉油 江西信江特種農副產品開發(fā)有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,西隴科學有限公司;C標準品、EC標準品、ECG標準品、EGC標準品、EGCG標準品 純度≥99%,上海源葉生物科技有限公司;茶多酚對照品 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;沒食子酸一水合物 阿拉丁試劑;丁基羥基茴香醚(BHA) 食品級,法國丹尼斯克;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 食品級,德國洋櫻集團有限公司;叔丁基對苯二酚(TBHQ) 食品級,河南弘成食品添加劑有限公司;維生素E 阿拉丁試劑。

RE-52A旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀 美國 Agilent公司;ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6×250 mm 5-Micron) 美國 Agilent公司;752S分光光度計 上海精若科學儀器公司;飛鴿TGL-15B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;AZ-B301榨油機 青島澳柯瑪生活電器有限公司;NAI-ZFCDY-6Z脂肪測定儀 上海那艾精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶葉籽油制備

1.2.1.1 壓榨毛油制備 將茶葉籽去殼,稱取4 kg茶葉籽仁,粉碎篩分得到60目的茶葉籽仁粉,并在900 W和80 ℃下微波處理80 s,用榨油機壓榨得到壓榨茶葉籽毛油,稱重,備用。

1.2.1.2 浸出毛油制備 將茶葉籽去殼,稱取2 kg茶葉籽仁,粉碎篩分得到60目的茶葉籽仁粉,并在900 W和80 ℃下微波處理80 s,置于燒瓶中,加入石油醚浸出,料液比(w/v)1∶4,浸泡24 h,每隔3 h攪拌1次,分離浸出液;再次以料液比(w/v)1∶2加入石油醚浸出,操作同上,分離并合并兩次浸出液,以0.09 MPa 40 ℃旋蒸回收石油醚,旋蒸至冷凝管無液滴流下,得到浸出茶葉籽毛油,稱重,備用。

1.2.1.3 茶葉籽粗脂肪制備 將茶葉籽去殼,稱取2 kg茶葉籽仁,粉碎篩分得到60目的茶葉籽仁粉,將20 g茶葉籽仁粉加入濾紙筒內,用脂肪測定儀提取粗脂肪,收集提取液,以0.09 MPa 40 ℃旋蒸回收石油醚,旋蒸至冷凝管無液滴流下,得到粗脂肪,稱重,備用。

1.2.2 提取茶多酚

1.2.2.1 提取油脂中茶多酚 取壓榨毛油、浸出毛油、茶葉籽粗脂肪、廠家提供毛油和精煉油各100 g,分別置于500 mL具塞三角瓶中,加入120 mL正己烷,充分振搖3 min,再加70%的甲醇溶液20 mL,充分振搖5 min,轉移至500 mL分液漏斗中靜置20 min,分液;再向上層液加入70%的甲醇溶液20 mL,重復提取一次,合并兩次下層提取液,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸濃縮至約1 mL,收集濃縮液,并用甲醇定容至2 mL,過膜,用于HPLC法測定。

取壓榨毛油、浸出毛油、茶葉籽粗脂肪、廠家提供毛油和精煉油各5 g,分別置于250 mL具塞三角瓶中,加入15 mL正己烷,充分振搖3 min,再加70%的甲醇溶液10 mL,充分振搖5 min,轉移至250 mL分液漏斗中,靜置20 min,分液;再向上層液加入70%的甲醇溶液10 mL,重復提取一次,合并兩次下層提取液,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸濃縮至約1 mL,收集濃縮液,并用甲醇定容至2 mL,用于福林酚法測定。

1.2.2.2 提取茶葉籽殼、仁及油粕中茶多酚 分別取三個產地茶葉籽的殼、仁、壓榨法所得油粕、浸出法所得油粕和索氏抽提所得脫脂茶葉籽仁粉各5 g,分別置于50 mL離心管中,加入預熱至70 ℃的70%的甲醇溶液10 mL,于70 ℃水浴鍋中提取10 min,5 min振蕩一次,然后以6000 r/min離心5 min,分離上層清液;重復上述提取步驟,每個樣品提取三次,合并提取液[15],過膜,用于HPLC法測定。

分別取三個產地茶葉籽的殼、仁、壓榨法所得油粕、浸出法所得油粕和索氏抽提所得脫脂茶葉籽仁粉各0.5 g,重復上一段所述提取操作,合并提取液,用于福林酚法測定。

1.2.3 茶多酚和兒茶素測定

1.2.3.1 福林酚法測茶多酚 參照GB/T 31740.2-2015茶制品第2部分:茶多酚附錄A使用茶多酚做對照品進行測定,將提取的茶多酚樣品與福林酚試劑反應1 h,以6000 r/min離心10 min再測定。

1.2.3.2 福林酚法檢出限和精密度 分別配制5～100 μg·mL-1的茶多酚和沒食子酸標準工作液,按福林酚法測定得到兩條標準曲線,以扣除空白吸光度值為0.01時對應的濃度作檢出限[16]。取10 μg·mL-1的茶多酚和沒食子酸溶液按福林酚法平行測定6次,計算RSD值。

1.2.3.3 HPLC法測兒茶素類 參照GB/T 31740.2-2015茶制品第2部分:茶多酚附錄B,修改流動相梯度洗脫程序,色譜條件如下:

流動相A:分別將90 mL乙腈,20 mL冰乙酸,2 mL EDTA-2Na溶液加入1 L定容瓶中,用水定容至刻度,搖勻,過0.45 μm膜;流動相B:分別將800 mL乙腈,20 mL冰乙酸,2 mL EDTA-2Na溶液加入1 L定容瓶中,用水定容至刻度,搖勻,過0.45 μm膜;洗脫程序:0～10 min流動相A比例100%,10～30 min流動相A降至60%,30 min后流動相A恢復至100%,至35 min結束;流速1 mL/min;進樣量10 μL;檢測器:紫外檢測器;檢測波長:278 nm;柱溫:35 ℃。

1.2.3.4 HPLC法檢出限和精密度 將兒茶素類標準液稀釋至HPLC峰高信號接近噪音值,以3倍信噪比對應濃度作方法檢出限。取200 μg·mL-1的標準液平行測定6次,計算各兒茶素的RSD值。

1.2.3.5 福林酚法干擾物質分析 取維生素E 0.5 g,置于250 mL具塞三角瓶中,加入15 mL正己烷,充分振搖3 min,再加70%的甲醇溶液10 mL,充分振搖5 min,轉移至250 mL分液漏斗中,靜置20 min,分液;再向上層液加入70%的甲醇溶液10 mL,重復提取一次,合并兩次下層提取液,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸濃縮至約1 mL,收集濃縮液,并用甲醇定容至2 mL;配制20 μg·mL-1的BHA、BHT和TBHQ甲醇溶液,按福林酚法測定這4個樣品的吸光度值。

1.2.4 測定方法重現性實驗

1.2.4.1 茶多酚精煉油膠體制備 精確稱取0.01 g茶多酚,用乙醇溶解并定容至200 mL,配得0.05 g·L-1的茶多酚乙醇溶液。分別稱取3份100 g茶葉籽精煉油,加熱至75 ℃,分別加入0.05 g·L-1茶多酚乙醇溶液8、12、16 mL,充分攪拌后,放入旋轉蒸發(fā)儀,以0.09 MPa 72 ℃旋蒸除去乙醇,旋蒸至冷凝管無液滴流下,再旋蒸0.5 h,制得4、6、8 mg·kg-1茶多酚精煉油膠體,將樣品轉移至玻璃瓶中待用。

1.2.4.2 福林酚法和HPLC法重現性 取6份廠家提供的茶葉籽毛油,以福林酚法測茶多酚含量,根據6份茶葉籽毛油茶多酚含量計算RSD值。再取6份廠家提供的茶葉籽毛油,以HPLC法測定兒茶素類含量,計算各兒茶素RSD值。

取5 g茶葉籽精煉油以福林酚法測吸光度值作空白,再分別取6份4、6、8 mg·kg-1茶多酚精煉油膠體,以福林酚法測茶多酚含量,計算回收率和4、6、8 mg·kg-1茶多酚精煉油膠體的RSD值。

1.3 數據處理

用Excel 2016分析實驗數據,計算RSD值,用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 測定方法的線性范圍、檢出限和精密度

2.1.1 福林酚法測茶多酚 由表1得以茶多酚對照品和沒食子酸作標準曲線的檢出限分別為0.149和0.153 μg·mL-1;RSD值分別為1.19%和0.72%,可知實驗方法精密度較好,符合實驗測定要求。采用茶多酚對照品所得標準曲線與按照GB/T 31740.2-2015附錄A中采用沒食子酸所得標準曲線不一致,同一樣品吸光度值經茶多酚標準曲線計算得到的含量較沒食子酸標準曲線所得含量更高。本文以茶多酚對照品所作標準曲線計算茶多酚含量。

表1 茶多酚的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和精確度Table 1 Liner ranges,liner equations,correlation coefficients,LODs and precision for tea polyphenols determination

2.1.2 HPLC測兒茶素類 按GB/T 31740.2-2015附錄B方法配制10～400 μg·mL-1標準工作液,經測定得五個兒茶素的標準曲線,數據見表2;可知各兒茶素檢出限和方法精密度符合測定要求。

表2 兒茶素類的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和精確度Table 2 Liner ranges,liner equations,correlation coefficients,LODs and precision for catechins determination

2.2 福林酚法和HPLC法對比

2.2.1 福林酚法測茶多酚含量和HPLC測兒茶素類總量 從表3測定結果可知:同一樣品經福林酚法測得茶多酚含量和HPLC法測得兒茶素總含量,茶多酚含量大于兒茶素總含量的10倍。福林酚法測定原理是:在堿性條件下,W6+氧化多酚,得到藍色的W5+,反映茶多酚含量,但易受其他物質干擾。HPLC法通過標準物質保留時間定性和峰面積定量測定目標物質及其含量,精確度較福林酚法高。色譜圖如圖1所示。

表3 茶葉籽油、茶葉籽和油粕中茶多酚含量和兒茶素總量Table 3 Contents of tea polyphenols and catechins in tea seed oil,tea seed and oil cakes

圖1 兒茶素標準品(A)和樣品(B)色譜圖Fig.1 The chromatography of catechin standard(A)and sample(B)

2.2.2 福林酚法干擾物質分析 由表4可知,維生素E、BHA、BHT和TBHQ是含酚羥基的脂溶性物質,在福林酚法測茶葉籽油中茶多酚時均可產生干擾。按茶多酚對照品制作的標準曲線公式換算,對應的茶多酚含量為5.877、4.242、4.440和4.889 mg·kg-1。維生素E為油脂伴隨物質,在測定茶葉籽毛油和精煉油中茶多酚含量時可產生干擾;BHA、BHT和TBHQ為常用的食用油抗氧化劑,對測定茶葉籽精煉油中茶多酚含量可產生干擾。油脂中除維生素E外,可能存在其他含酚羥基物質,因此,以福林酚法測茶葉籽油中茶多酚時,不能排除這些物質對測定結果的干擾。

表4 福林酚法測得維生素E、BHA、BHT和TBHQ的吸光度值Table 4 Absorbance values of vitamin E,BHA,BHT and TBHQ were measured by Folin phenol method

2.3 兩種方法測定茶多酚含量的重現性

2.3.1 福林酚法測定茶多酚含量的重現性 由表5得RSD值為7.21%,重現性差。GB/T 31740.2-2015附錄A要求樣品提取液與10%福林酚試劑反應后室溫靜置1 h后進行測定,驗證福林酚法穩(wěn)定性,取茶葉籽殼提取液按照福林酚法反應后,每10 min測一次吸光度值,反應液吸光度值變化如圖2所示,60 min后吸光度值穩(wěn)定,90 min后略微增加;樣品提取液與10%福林酚試劑反應后60～90 min內能完成一批樣品測定,則各樣品測定先后順序不影響實驗結果準確性和一致性。

表5 福林酚法測茶葉籽毛油茶多酚含量重現性Table 5 Reproducibility of Folin phenol method for determination of tea polyphenols content in tea seed oil

圖2 福林酚法樣品穩(wěn)定性Fig.2 Stability of sample measured by Folin phenol method

2.3.2 HPLC法測定兒茶素類含量的重現性 結果如表6所示,各兒茶素的RSD值不同,其中EGCG和ECG重現性差,但兒茶素總含量重現性較好,可滿足測定要求。

表6 HPLC法測茶葉籽毛油兒茶素類含量重現性Table 6 Reproducibility of HPLC for determination of catechins content in tea seed oil

2.3.3 以福林酚法測定茶多酚精煉油膠體中茶多酚的回收率和重現性 如圖3所示,1號樣品是茶多酚精煉油膠體,2號樣品是茶葉籽精煉油;制備的茶多酚精煉油膠體在一段時間內澄清透明,不產生沉淀,一束光穿過產生丁達爾效應,表明茶多酚呈納米級或準納米級晶體均勻分布于茶葉籽精煉油內。

圖3 茶多酚精煉油膠體丁達爾效應Fig.3 Tyndall phenomenon of tea polyphenol colloid

用福林酚法測茶多酚精煉油膠體中茶多酚含量,以茶葉籽精煉油作空白,可扣除福林酚法干擾。精煉油膠體中茶多酚的回收率和重現性測定結果如表7所示,3個加標量平行測定6次的回收率為90.97%～109.00%,可知本實驗預處理方法和測定方法可信度較好。測定茶多酚精煉油膠體中茶多酚含量重現性較好,3組實驗樣品RSD值均小于3%;與表5福林酚法測茶葉籽毛油中茶多酚含量和表6 HPLC法測茶葉籽毛油中兒茶素類含量數據對比,可知茶葉籽毛油中茶多酚分布不均勻。

表7 福林酚法測茶多酚精煉油膠體中茶多酚含量回收率和重現性Table 7 Reproducibility and recovery rate of Folin phenol method for determination of tea polyphenols content in tea polyphenol colloid

3 結論

以福林酚法測得茶葉籽毛油中茶多酚含量為16.311～27.596 mg·kg-1,按60%～80%計算所含兒茶素總含量,遠超HPLC法測得兒茶素總含量0.627～1.639 mg·kg-1。茶葉籽油中維生素E和帶有酚羥基的油脂抗氧化劑對福林酚法測油脂中茶多酚產生干擾,因此,福林酚法不適用于測定油脂中茶多酚含量。

以福林酚法測茶葉籽毛油中茶多酚含量重現性較差;HPLC法測茶葉籽毛油中單一兒茶素重現性差,但測兒茶素總含量重現性較好。用福林酚法測精煉油膠體茶多酚含量,因茶多酚分布均勻,重現性較HPLC法測兒茶素總含量更好?；厥章蕦嶒炛?三組實驗樣品回收率為90.97%～109.00%,可知本實驗中預處理方法和測定方法可信度較好。實驗結果證明茶葉籽毛油中茶多酚能以相對穩(wěn)定狀態(tài)存在,但分布不均勻。