周 艷,祁 艷,紀(jì) 瑞,譚 俊,*,陳代杰,3,*

(1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院,上海 200040; 2.復(fù)旦大學(xué),上海 200120; 3.上海交通大學(xué),上海 200240)

雙歧桿菌是存在于人體腸道內(nèi)的具有重要益生功能的厭氧微生物,具有調(diào)節(jié)腸道微生物群、抵抗病原微生物及提高機(jī)體免疫力等功能[1-2]。有研究表明[3],雙歧桿菌能夠通過自身的生物轉(zhuǎn)化吸收利用培養(yǎng)基中的元素,同時(shí)改變自身的生理生化特性。據(jù)此,研究人員可以采用特定的培養(yǎng)條件,使益生菌特定地富集某種元素,有目的地改進(jìn)其生理特性,從而豐富并優(yōu)化其益生功能[4]。硒元素是人體所必需的微量元素,具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)活性,對(duì)人體的健康有諸多益處[5]。在高硒環(huán)境中發(fā)酵培養(yǎng)益生菌,使其將無機(jī)硒吸收轉(zhuǎn)化為自身硒蛋白,即可制備有機(jī)硒和益生菌雙重功效的富硒益生菌[6]。

雙歧桿菌能否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生益生作用與其能否在消化道內(nèi)黏附、定植有關(guān),其中黏附是其發(fā)揮作用的先決條件[7-8]。雙歧桿菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附能力、對(duì)胃酸膽鹽的耐受力均會(huì)影響其在腸道的定植,因此分離培養(yǎng)得到具備腸道定植能力的雙歧桿菌具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。體內(nèi)研究益生菌對(duì)人腸道上皮細(xì)胞黏附性較為困難,體外研究益生菌黏附能力常用模型為人結(jié)腸癌細(xì)胞系的Caco-2細(xì)胞株,該細(xì)胞株在體外培養(yǎng)后能夠較好地模擬人體腸上皮細(xì)胞的成熟形態(tài)[9]。同時(shí)研究表明[10-11],菌體表面疏水性、自聚集能力與細(xì)菌黏附性存在一定的相關(guān)性,細(xì)菌黏附能力與細(xì)菌表面性質(zhì)有直接關(guān)系。表面疏水性(Cell surface hydrophobicity,CSH)常作為評(píng)價(jià)細(xì)菌黏附性的指標(biāo)[12],用于表明細(xì)菌表面具有非極性成分,使菌體在極性較高的水中表現(xiàn)出非穩(wěn)態(tài),并引起非穩(wěn)態(tài)體系中的熱能和分子的重新排列[13]。自動(dòng)聚集能力是指在培養(yǎng)菌體過程中,菌體快速大量繁殖從而自行聚集成團(tuán)的現(xiàn)象[14]。菌體的自動(dòng)聚集能力有助于其生物膜形成,從而能夠在腸道內(nèi)提前占位,抑制致病菌對(duì)人體腸道的侵襲[15]。

目前,有關(guān)雙歧桿菌一類益生菌的黏附特性研究較多。Del等[16]研究雙歧桿菌的黏附能力時(shí),發(fā)現(xiàn)不同種類長(zhǎng)雙歧桿菌間黏附能力存在差異性。研究初步證明,細(xì)胞壁蛋白Tuf參與了B.LongumNCC2705黏附于Caco-2細(xì)胞的過程中,且Tuf蛋白能夠明顯抑制競(jìng)爭(zhēng)性菌體黏附于Caco-2細(xì)胞,為黏附相關(guān)蛋白[17]。但關(guān)于富硒培養(yǎng)對(duì)益生菌黏附性質(zhì)的影響研究尚未報(bào)道。本研究旨在探討一株新的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株DD98在富硒前后的黏附特性變化,并根據(jù)相關(guān)黏附蛋白Tuf轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況,對(duì)富硒培養(yǎng)前后菌體黏附能力變化的機(jī)制進(jìn)行初步探索,為研究和開發(fā)益生活性更優(yōu)的新型富硒益生菌產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長(zhǎng)雙歧桿菌DD98菌株(CGMCC No. 16573) 本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)高通量篩選得到耐硒長(zhǎng)雙歧桿菌菌株[18],經(jīng)16S rRNA測(cè)序及核苷酸序列BLAST分析,結(jié)果表明DD98菌株是一種新的長(zhǎng)雙歧桿菌;人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2株 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司惠贈(zèng);高糖型DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清 Gibco;青鏈霉素(雙抗) Thermo Scientific;胰蛋白酶、臺(tái)盼藍(lán)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO) 上海合谷生物科技有限公司;亞硒酸鈉 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;海藻糖 日本林源；脫脂奶粉 新西蘭恒天然公司；二甲苯、硝酸鉀、乙醇、尿素、SDS等 國(guó)藥試劑。

400M厭氧培養(yǎng)箱 RUSKINN;SPX-150B-Z二氧化碳培養(yǎng)箱 松下電器產(chǎn)業(yè);HITACHI S-4800型掃描電鏡 株式會(huì)社日立制作所;SP-756P紫外分光光度計(jì)、Multiskan Go酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司;XSP-2CA倒置顯微鏡 上海締綸光學(xué)儀器有限公司;TL-18M冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;T100熒光定量PCR儀器 伯樂Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品及培養(yǎng)基制備 RCM培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、牛肉粉10.0 g、酵母粉3.0 g、葡萄糖5.0 g,可溶性淀粉1.0 g、氯化鈉5.0 g、醋酸鈉3.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、瓊脂0.5 g、蒸餾水1000 mL,pH6.7～6.9,121 ℃滅菌15 min。

DD98的培養(yǎng):將長(zhǎng)雙歧桿菌DD98接種于RCM培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)24 h,收集菌體。

Se-DD98的培養(yǎng):將長(zhǎng)雙歧桿菌DD98接種于RCM培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)12 h后,向培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,在高硒環(huán)境下發(fā)酵制備Se-DD98。

將DD98及Se-DD98分別與凍干保護(hù)劑(海藻糖2%、脫脂奶粉10%，水70%)1∶1混合后,冷凍干燥48 h后得到凍干菌粉,密封保存于4 ℃,實(shí)驗(yàn)前采用平板涂布法檢測(cè)樣品活菌數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 液氮罐中取出Caco-2細(xì)胞,將凍存管迅速置于37 ℃水浴中復(fù)蘇細(xì)胞,離心(1000 r/min,3 min)收集細(xì)胞后,加入4 mL含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底長(zhǎng)滿至80%時(shí),需要進(jìn)行傳代[19]。

用于黏附試驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞6孔培養(yǎng)板中,接種量為105個(gè),待單層細(xì)胞匯合之后,繼續(xù)培養(yǎng)10～15 d,即可用于黏附試驗(yàn)。進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)前24 h,需要提前更換為無雙抗DMEM培養(yǎng)基(含有血清,不含抗生素)。

1.2.3 掃描電鏡觀察菌株黏附情況 采用無雙抗的DMEM培養(yǎng)基將DD98及Se-DD98凍干菌粉濃度調(diào)整至108CFU/mL[15],然后加入到培養(yǎng)在6孔板中的已分化的Caco-2細(xì)胞層中,于37 ℃、5% CO2、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)2 h。無菌PBS(pH7.4)洗滌5次,以除去未黏附的細(xì)菌后,取出6孔培養(yǎng)板中黏附細(xì)胞的蓋玻片,加入2.5%的戊二醛固定過夜;采用PBS緩沖液漂洗樣品3次,每次10 min;鋨酸固定樣品30 min后,以PBS緩沖液漂洗3次;樣品于30%、50%、70%、90%、100% 梯度乙醇中脫水,每次15 min,樣品經(jīng)由無水乙醇/醋酸異戊酯(1∶1)的混合液過渡后,轉(zhuǎn)入純醋酸異戊酯,每次約10 min以置換酒精,樣品置于預(yù)冷干燥室進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥(約4 h),噴金后采用掃描電鏡觀察[20]。

1.2.4 菌株黏附能力的測(cè)定 細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)及處理同1.2.3。無菌PBS(pH7.4)洗滌5次以除去未黏附的細(xì)菌后,加入胰酶250 μL,37 ℃孵育10 min,釋放細(xì)胞上已黏附的細(xì)菌,然后向培養(yǎng)板每個(gè)孔中添加250 μL含無雙抗DMEM的培養(yǎng)基以終止胰酶活力,用1 mL移液器將Caco-2細(xì)胞層吹打下來。黏附細(xì)菌經(jīng)無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后,涂布于RCM固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),菌株的黏附能力以每100個(gè)Caco-2細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)量(CFU/100 cells)表示[21],進(jìn)行3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),計(jì)數(shù)樣品均在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)。

1.2.5 菌體自聚合能力的測(cè)定 參考Collado等[22]、Tuo等[23]研究方法,將DD98及Se-DD98的細(xì)菌培養(yǎng)物,在室溫下離心(6000 r/min,10 min),棄上清,收集菌體。菌體用滅菌的PBS(pH7.2)溶液洗滌兩次,并重懸于PBS 溶液中,使其在600 nm下的吸光度達(dá)到0.5±0.02(記為A0)。將細(xì)胞懸液渦旋振蕩15 s,于37 ℃分別靜置30、60、90、120、150、180 min。吸取1 mL靜置后的上清,測(cè)定其在600 nm的吸光度(At)。按公式(1)計(jì)算自聚合能力,重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)取平均值。

自聚合能力(%)=(1-At/A0)×100

式(1)

式中:A0:菌體懸液的初始吸光度;At:靜置不同時(shí)間后上清的吸光度。

1.2.6 菌體表面疏水性的測(cè)定 參考Rong等[24]研究方法,將DD98及Se-DD98菌液,在室溫下離心(6000 r/min,10 min),倒去上清,收集菌體,菌體經(jīng)PBS清洗2次后,再重懸于滅菌的0.1 mol/L KNO3溶液中。在600 nm處調(diào)節(jié)吸光度為0.5±0.02,記作A0。取3 mL菌懸液與1 mL二甲苯混勻后在室溫靜置10 min(此時(shí)形成兩相體系)。將兩相體系渦旋振蕩2 min后再靜置20 min,重新形成兩相體系(水相和有機(jī)相)。小心吸取水相,在600 nm下測(cè)定吸光度(A)。按公式(2)計(jì)算細(xì)菌表面疏水性,重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)取平均值。

表面疏水性(%)=(1-A/A0)×100

式(2)

式中:A0:菌體懸液的吸光度;A:兩相混合后水相的吸光度。

1.2.7 Tuf蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況的測(cè)定 收集與Caco-2細(xì)胞共孵育0、2 h的DD98及Se-DD98菌液混合物,使用RNA抽提試劑盒提取樣品RNA,并進(jìn)一步將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將所得cDNA稀釋后與引物、SYBRGreen qPCRMix反應(yīng)液混合,在Bio-Rad T100熒光定量PCR儀器進(jìn)行反應(yīng),PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。16S rRNA作為內(nèi)參基因,引物序列[25]見表1。

表1 熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)引物Table 1 Fluorescent quantitative RT-PCR experiment primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 Se-DD98及DD98對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附現(xiàn)象觀察結(jié)果

Se-DD98及DD98黏附于Caco-2單層細(xì)胞膜后,掃描電鏡觀察結(jié)果見圖1。由圖1可知,兩種長(zhǎng)雙歧桿菌菌體形態(tài)完整,邊緣清晰,均附著凍干保護(hù)劑顆粒,部分菌體出現(xiàn)凍干后的皺縮,電鏡觀察結(jié)果表明,富硒長(zhǎng)雙歧桿菌及長(zhǎng)雙歧桿菌均能夠黏附于Caco-2單層細(xì)胞膜上。

圖1 掃描電鏡下Se-DD98及DD98對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附情況(×103)Fig.1 Adhesion of Se-DD98 and DD98 strains to Caco-2 cells under scanning electron microscope(×103)注:A:單純Caco-2細(xì)胞膜;B:Se-DD98黏附于 Caco-2細(xì)胞膜;C:DD98黏附于Caco-2細(xì)胞膜。

2.2 Se-DD98及DD98對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

以Caco-2細(xì)胞為體外模型,采用平板計(jì)數(shù)法,分析Se-DD98、DD98對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力,結(jié)果見圖2。由圖2可知,相比DD98,Se-DD98能夠黏附更多菌體在Caco-2細(xì)胞上,每100個(gè)Caco-2細(xì)胞平均黏附的DD98菌體為(39.12±17.57) CFU,每100個(gè)Caco-2細(xì)胞平均黏附Se-DD98菌體為(581.17±62.79) CFU。結(jié)果表明,長(zhǎng)雙歧桿菌DD98菌株經(jīng)富硒培養(yǎng)后,對(duì)Caco-2細(xì)胞膜的黏附能力極顯著提高(p<0.01)。

圖2 Se-DD98及DD98對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附能力Fig.2 Adhesion ability to Caco-2 cell of Se-DD98 and DD98 strains注:與DD98組相比,**表示差異極顯著,p<0.01, *表示差異顯著,p<0.05;圖4～圖5同。

2.3 自動(dòng)聚集能力的測(cè)定

Se-DD98及DD98菌株自動(dòng)聚集能力測(cè)定結(jié)果見圖3。由圖3可知,隨著時(shí)間的推移,兩組細(xì)菌懸浮液上層細(xì)胞均逐漸沉降,到180 min后,細(xì)菌懸浮液上層渾濁度明顯下降,自聚合能力明顯提高。相比DD98,Se-DD98的自動(dòng)聚集能力略有上升,但無顯著差別。

圖3 Se-DD98及DD98在不同時(shí)間點(diǎn)自動(dòng)聚集能力Fig.3 Auto-aggregation ability of Se-DD98 and DD98 strains

2.4 表面疏水性的測(cè)定

研究認(rèn)為,細(xì)菌表面疏水性是由其表面蛋白、糖類及其他化合物所共同形成的一種菌體表面特性[22]。Se-DD98與DD98在碳?xì)浠衔锒妆街械谋砻媸杷匀鐖D4所示。由圖4可知,相比DD98,Se-DD98在碳?xì)浠衔锒妆街斜憩F(xiàn)出較高的表面疏水性,其結(jié)果平均為20.25%±2.14%,DD98的表面疏水性平均僅為5.12%±0.16%,兩者有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果表明,長(zhǎng)雙歧桿菌在高硒壓力下培養(yǎng)后,菌體表面性質(zhì)發(fā)生改變,菌株表面疏水性增加。研究發(fā)現(xiàn),菌體表面疏水性與其黏附能力呈正相關(guān)[16],據(jù)此可推測(cè)DD98菌株富硒培養(yǎng)后,其黏附能力增加,更易黏附并定植于機(jī)體腸道內(nèi)壁。

圖4 Se-DD98及DD98的表面疏水性Fig.4 Cell surface hydrophobicity of Se-DD98 and DD98 strains

2.5 細(xì)菌表面Tuf蛋白mRNA表達(dá)情況

細(xì)菌表面Tuf蛋白是已經(jīng)報(bào)道過的兼職蛋白,具有翻譯因子、宿主蛋白Plg受體雙重功能[23]。研究證實(shí),Tuf蛋白可以直接與人纖溶酶原(Plg)相互作用,是Plg的受體,在長(zhǎng)雙歧桿菌黏附于腸上皮細(xì)胞的過程中產(chǎn)生重要影響[24]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物,以轉(zhuǎn)錄相對(duì)保守16S rRNA作為內(nèi)參,通過熒光定量RT-PCR法,檢測(cè)Se-DD98及DD98與Caco-2細(xì)胞共孵育0、2 h,細(xì)菌表面Tuf蛋白mRNA的表達(dá)量,結(jié)果以2-ΔΔCt值表示,其Tuf蛋白mRNA表達(dá)情況如圖5所示。由圖5可知,與Caco-2細(xì)胞共孵育前,Se-DD98與DD98菌體Tuf蛋白mRNA表達(dá)量無明顯差異。與Caco-2細(xì)胞共孵育2 h后,DD98及Se-DD98Tuf蛋白mRNA表達(dá)量相比與細(xì)胞孵育前均上調(diào),且相比DD98,Se-DD98的Tuf蛋白mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)更多(p<0.05)。推測(cè)長(zhǎng)雙歧桿菌DD98菌株富硒培養(yǎng)后具有更高的黏附能力與細(xì)菌表面Tuf蛋白mRNA的表達(dá)有關(guān)。

圖5 Se-DD98及DD98與Caco-2細(xì)胞共孵育 2 h后其Tuf蛋白mRNA表達(dá)情況Fig.5 The Tuf protein mRNA transcription result of Se-DD98 and DD98 after co-incubation with Caco-2 cells for 2 h

3 結(jié)論

菌體黏附能力是雙歧桿菌在腸道中定植的先決條件,也是其發(fā)揮益生功能的基礎(chǔ)。本研究以DD98為對(duì)象,在以Caco-2為模型、研究其富硒前后黏附能力變化的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Se-DD98的黏附能力明顯升高。在菌體表面性質(zhì)的研究中,發(fā)現(xiàn)Se-DD98菌體表面疏水性極顯著升高(p<0.01),表明富硒培養(yǎng)能夠改變DD98的表面特性,使其黏附能力增強(qiáng),推測(cè)富硒培養(yǎng)使雙歧桿菌表面黏附相關(guān)蛋白發(fā)生改變,從而引起菌體黏附能力升高。本通過熒光定量RT-PCR法,分析與Caco-2細(xì)胞共孵育0、2 h的Se-DD98及DD98的Tuf蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄情況,發(fā)現(xiàn)相比DD98,Se-DD98的Tuf黏附蛋白mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)更多(p<0.05),推測(cè)Se-DD98具有更高的黏附能力與Tuf黏附蛋白的轉(zhuǎn)錄能力有關(guān),具體機(jī)制還需更進(jìn)一步的研究。