任海燕　弓桂花　王永康　趙愛(ài)玲　薛曉芳

摘要：為深入研究棗體細(xì)胞胚胎發(fā)生的形態(tài)建成過(guò)程，以‘小梨棗’幼胚為材料，采用蘇木精-伊紅法染色和石蠟切片技術(shù)對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生、發(fā)育進(jìn)行了組織學(xué)觀察。結(jié)果表明：胚型愈傷組織細(xì)胞體積小，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞排列緊密;而非胚性愈傷組織細(xì)胞體積大，細(xì)胞核小，細(xì)胞質(zhì)稀薄。體細(xì)胞胚產(chǎn)生于幼胚愈傷組織的表層細(xì)胞或內(nèi)部細(xì)胞，且發(fā)生不同步，其發(fā)育過(guò)程與合子胚發(fā)育過(guò)程相似，即經(jīng)歷球形期、心形期和魚(yú)雷期，最終形成子葉形胚。

關(guān)鍵詞：棗;幼胚;體細(xì)胞胚;組織學(xué)觀察

中圖分類(lèi)號(hào)：Q ???文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ???論文編號(hào)：cjas18050007

Somatic Embryogenesis and Development in Ziziphus jujuba Mill.： Histological Observation

Ren Haiyan1，2， Gong Guihua1， Wang Yongkang1， Zhao Ailing1， Xue Xiaofang1

（1Institute of Pomology， Shanxi Academy of Agricultural Science/The Key Research Team of Genetic Improvement and Utilization of Jujube Resource/Shanxi Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Use of Pomology， Taigu 030815， Shanxi， China; 2School of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China）

Abstract： The paper aims to study the morphogenesis process of somatic embryogenesis. We used young embryos of Ziziphus jujuba ‘Xiaolizao’ as explants， and carried out the histological observation of somatic embryo formation and development by using the method of hematoxylin-eosin staining and paraffin section.?The results indicated that： the embryogenic callus cells had the characteristics of small size， large nucleus， thick cytoplasm and the cells were closely arranged; however， the non- embryogenic callus cells were?characterized with large size， small nucleus and thin cytoplasm. The somatic embryos were originated from?surface calluscells and inner calluscells of immature embryos and their development were not synchronized?which was similar to the embryonic development process of zygotes， the somatic embryos also experienced the spherical stage， the heart-shaped stage， the torpedo stage and ultimately formed cotyledon embryos.

Keywords： Chinese Jujube; Young Embryo; Somatic Embryogenesis; Histological Observation

0 引言

體細(xì)胞胚或胚狀體的發(fā)生，最初在1958年Steward利用胡蘿卜韌皮部組織，誘導(dǎo)愈傷組織，通過(guò)液體培養(yǎng)產(chǎn)生具有胚胎結(jié)構(gòu)的組織。體細(xì)胞胚胎發(fā)生多具有單細(xì)胞起源的特點(diǎn)，且高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚發(fā)生系統(tǒng)對(duì)于基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化、品種改良等方面的研究都具有十分重要的意義。

目前，雖有一些關(guān)于棗胚經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生獲得植株的研究報(bào)道，如陳維倫等[1]對(duì)酸棗胚進(jìn)行無(wú)性胚狀體發(fā)生并獲得植株;李登科等[2]對(duì)六月鮮棗幼胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功獲得了胚狀體及再生苗;張存智[3]以胚齡50～60天隴東馬牙棗為試材成功誘導(dǎo)出胚狀體及再生苗植株。從已有報(bào)道來(lái)看，幼胚較適宜作為體胚發(fā)生的外植體，但關(guān)于棗體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育的組織學(xué)觀察研究較少，特別是以幼胚為外植體方面的研究。目前僅見(jiàn)郝建平等[4]對(duì)‘晉矮1號(hào)’等棗合子胚和體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了觀察與比較;程佑發(fā)等[5]對(duì)‘臨澤小棗’子葉體細(xì)胞胚發(fā)生和組織學(xué)研究。本研究以‘小梨棗’幼胚為材料，運(yùn)用石蠟切片，從組織學(xué)方面對(duì)棗體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)方面的差異進(jìn)行了研究，以揭示棗幼胚體細(xì)胞胚胎的發(fā)育過(guò)程，以期為棗幼胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生提供細(xì)胞水平證據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2013—2015年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家棗資源圃進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料‘小梨棗’為可育率較高的棗品種，其盛花期為6月上旬，期間選取黃蕾期開(kāi)放的棗花掛牌標(biāo)記為定花，由定花所結(jié)得果為定果，根據(jù)定花和定果確定胚齡。選取胚齡30～40天的幼果。

將采集的幼果帶回實(shí)驗(yàn)室，流水沖洗1h，75%酒精浸泡30s，無(wú)菌水洗2次，再用0.1%HgCl2振蕩3min，無(wú)菌水洗5次，用手術(shù)刀將棗果剖開(kāi)，取出胚珠，剝?nèi)ネ獗砥ず笠院宵c(diǎn)端插入培養(yǎng)基的豎放方式接種在培養(yǎng)基中，所有操作均在超凈臺(tái)上進(jìn)行。培養(yǎng)溫度為24℃±2℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度3000 lx。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 胚乳看護(hù)培養(yǎng) 將‘小梨棗’胚珠置于胚乳看護(hù)培養(yǎng)基MS+IBA0.2mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+LH0.5g/L+蔗糖7%+瓊脂5.5g/L，pH調(diào)至5.8，培養(yǎng)30天，獲得可見(jiàn)幼胚。

1.3.2 愈傷組織誘導(dǎo) 將獲得的幼胚接種于MS+TDZ0.6mg/L+IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L，培養(yǎng)40天，誘導(dǎo)胚性愈傷組織。

1.3.3 體細(xì)胞胚的發(fā)生與成熟 將挑取的胚性愈傷組織接種于MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.02mg/L，培養(yǎng)20天，誘導(dǎo)產(chǎn)生原胚，轉(zhuǎn)接于MS+ABA0.5mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20天。

1.3.4 體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程的組織形態(tài)學(xué)觀察 將上述胚性細(xì)胞誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程中獲得的材料用FAA固定液固定，石蠟切片法制片。切片厚度9μm，采用蘇木精-伊紅法染色。于Olympus CXA1型系統(tǒng)顯微鏡下觀察。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程的觀察

胚齡30天的胚珠外表皮呈白色，易剝離，胚不可見(jiàn)，胚乳呈透明液體狀。胚齡40天的胚珠表皮呈黃白色，有韌性，胚乳呈乳白色，半透明半固體狀，經(jīng)胚乳看護(hù)培養(yǎng)，形成可見(jiàn)的球狀體幼胚（見(jiàn)圖1A）。

將球狀體的幼胚（見(jiàn)圖1B）轉(zhuǎn)接進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，10天后幼胚膨大、表面變?yōu)榇植冢?5天后表面可見(jiàn)許多凸起的細(xì)胞團(tuán)，呈不規(guī)則形態(tài)，并開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織，顏色為黃白色。幼胚培養(yǎng)34天后一些幼胚表面產(chǎn)生的愈傷組織整體為乳黃或淡黃色，質(zhì)地緊密，呈團(tuán)塊裝，為非胚性愈傷組織（見(jiàn)圖1C）。多數(shù)愈傷組織中形成淡黃色、半透明顆粒狀、質(zhì)地疏松，易分離的胚性愈傷組織（見(jiàn)圖1D）。體細(xì)胞胚經(jīng)圓胚團(tuán)階段、隨著極性結(jié)構(gòu)的形成，體細(xì)胞胚不斷發(fā)育，球體不斷膨大，胚性頭部擴(kuò)展伸長(zhǎng)，形成棒狀體（見(jiàn)圖1E）。棒狀體進(jìn)一步發(fā)育，頭部形成子葉原基凸起，隨后子葉原基發(fā)育成幼小子葉（見(jiàn)圖1F）。隨著體細(xì)胞不斷的成熟，子葉不斷發(fā)育和生長(zhǎng)變綠，頂端胚芽開(kāi)始生長(zhǎng)，胚根伸長(zhǎng)，體胚萌發(fā)成再生植株（見(jiàn)圖1G）。

2.2 體細(xì)胞胚的發(fā)生發(fā)育的組織學(xué)觀察

棗幼胚體細(xì)胞胚以間接方式發(fā)生，即先由幼胚脫分化產(chǎn)生愈傷組織，再?gòu)挠鷤M織上分化形成體細(xì)胞胚。

組織學(xué)觀察表明，愈傷組織細(xì)胞主要有兩類(lèi)，一類(lèi)細(xì)胞排列松散而核小，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞質(zhì)稀薄，液泡化，含水量大，細(xì)胞體積較大，形狀不規(guī)則，多為長(zhǎng)形、長(zhǎng)橢圓形，從石蠟切片觀察看染色較淺，這類(lèi)排列松散的細(xì)胞稱(chēng)為非胚性細(xì)胞（見(jiàn)圖1H）。非胚性愈傷邊緣的細(xì)胞通過(guò)活躍的分裂活動(dòng)、快速的分裂和增殖，可以轉(zhuǎn)化為胚性愈傷組織細(xì)胞。另一類(lèi)細(xì)胞多位于從表面或表層細(xì)胞的分生中心，與非胚性細(xì)胞相比，這類(lèi)細(xì)胞細(xì)排列緊密，胞壁較厚，細(xì)胞核大而明顯且多位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞內(nèi)通常積累大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，體積相對(duì)小，形狀較為整齊，這類(lèi)細(xì)胞為體細(xì)胞胚胎的發(fā)生做準(zhǔn)備，稱(chēng)為胚性細(xì)胞（見(jiàn)圖1I）。

這些胚性細(xì)胞早期分裂形成顏色較深的多細(xì)胞原胚，多細(xì)胞原胚繼續(xù)呈縱向、橫向分裂。隨著體胚不斷發(fā)育，胚性頭部的球體不斷膨大，表面變光滑，細(xì)胞質(zhì)密有規(guī)則，進(jìn)而形成明顯的孤立化狀態(tài)的球形胚（見(jiàn)圖1J），有的球形胚從愈傷組織中脫落下來(lái)。球形胚進(jìn)一步發(fā)育時(shí)可見(jiàn)到明顯的形成層分布，隨著內(nèi)部組織分化的推進(jìn)，胚體兩端加速生長(zhǎng)呈心形的，此時(shí)的體胚為心形胚階段（見(jiàn)圖1K～L）。心形胚繼續(xù)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)發(fā)育成魚(yú)雷形胚（見(jiàn)圖1M），魚(yú)雷形胚進(jìn)一步發(fā)育成子葉形胚，有些子葉原基在發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞分裂生長(zhǎng)不平衡，造成子葉的長(zhǎng)短不一（見(jiàn)圖1N），但最終形成完整植株。

3 討論

生理隔離是體細(xì)胞胚胎發(fā)育的前提條件，如不能形成生理隔離就不能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚細(xì)胞的分化和細(xì)胞全能性的表達(dá)，從而導(dǎo)致體胚中途死亡或畸形。呂秀立等[6]觀察表明，七葉樹(shù)體細(xì)胞胚有發(fā)育良好的表皮層，特別是成熟胚具備良好的V字型維管束，與愈傷組織間沒(méi)有微管組織聯(lián)系，具有生理隔離性。本研究觀察到‘小梨棗’體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)生理隔離現(xiàn)象，胚性愈傷組織中的胚性細(xì)胞和非胚性細(xì)胞在形態(tài)上有較大的差別，隨著胚性愈傷組織的不斷生長(zhǎng)發(fā)育，形態(tài)與生理上的隔離也逐漸明顯，尤在球形胚和心形胚期，在球形胚時(shí)期，有的球體己與母體完全脫離。

關(guān)于體細(xì)胞胚的發(fā)生，多數(shù)研究認(rèn)為體細(xì)胞胚多發(fā)生于胚性愈傷組織表層，如龍眼[7]、鵝掌揪[8]、欒樹(shù)[9]、香蕉[10]、花生[11-12]、百合[13]、黃榆[14]等，而少數(shù)發(fā)生于胚性愈傷組織內(nèi)部的體細(xì)胞胚容易中途停止發(fā)育形成畸形胚，甚至死亡。王娜[15]認(rèn)為，生理隔離和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足可能是造成胚性愈傷組織內(nèi)部體細(xì)胞胚中途死亡或畸形的原因之一。

體細(xì)胞胚發(fā)生是對(duì)合子胚形態(tài)發(fā)生全過(guò)程的重演[16]。不同植物體細(xì)胞胚發(fā)育經(jīng)歷的階段不同。香榧體細(xì)胞胚的發(fā)育經(jīng)歷了原胚、球形胚、棒狀胚、心形胚、魚(yú)雷形胚和子葉形胚6個(gè)階段[17]。攸縣油茶胚性細(xì)胞團(tuán)經(jīng)球形胚、心形胚、子葉形胚發(fā)育成了完整植株[18]。云杉體細(xì)胞胚發(fā)育經(jīng)過(guò)早期原胚、球形胚、早期體胚及子葉胚4個(gè)階段[19]。山杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中可明顯看出球形胚、心形胚、魚(yú)雷形胚、子葉胚階段[20]。本試驗(yàn)觀察表明，‘小梨棗’體細(xì)胞胚發(fā)生不同步，經(jīng)歷了原胚、球形期、心形期、魚(yú)雷形胚、子葉形胚5個(gè)階段，與合子胚的發(fā)生途徑相同。這與郝建平等[4]、程佑發(fā)[4]等研究結(jié)果一致。

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