魏如男 王富平 張媚 陳忠敏

摘要： 研究絲素肽（SFP）絡(luò)合Ca2+含量對(duì)人正常肝細(xì)胞L02生長(zhǎng)的影響。采用CaCl2-乙醇-水三元體系制備絲素蛋白（SF），并獲得不同Ca2+含量的SFP后進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí);采用EDTA滴定法測(cè)定SFP中Ca2+含量，細(xì)胞增殖率評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性，圓二色譜（CD）檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：隨透析時(shí)間（12、24、36h）增加，SFP中Ca2+含量分別為16.00%、9.60%、0.40%，逐漸減小，對(duì)L02的生長(zhǎng)作用由促進(jìn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种?，其中在SFP相對(duì)分子質(zhì)量大于8kD時(shí)尤為明顯，L02細(xì)胞增殖率從（11868%±3.65%）減小到（59.78%±1.70%），對(duì)應(yīng)SFP二級(jí)結(jié)構(gòu)中3.43%的α螺旋和5.35%的無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B。當(dāng)SFP應(yīng)用于組織工程支架領(lǐng)域時(shí)，絡(luò)合較高Ca2+含量的SFP更有利于細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞： 絲素肽;鈣離子含量;細(xì)胞生長(zhǎng)作用;相對(duì)分子質(zhì)量;二級(jí)結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： R318.08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)： 1001-7003（2019）03-0007-05

引用頁碼： 031102

Study on the effect of silk fibroin peptide complex Ca2+ content on cell growth

WEI Ru’nan， WANG Fuping， ZHANG Mei， CHEN Zhongmin

（College of Pharmacy and Bioengineering， Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China）

Abstract： The effects of silk fibroin peptide （SFP） complex Ca2+ content on the growth of human normal hepatocyte L02 were studied. The CaCl2-ethanol-water system was used to prepare silk fibroin （SF）， and SFP with different Ca2+ content was obtained. Then， the relative molecular mass of SFP was classified. The content of Ca2+ in SFP was measured by EDTA titration. The cytotoxicity of L02 cells was evaluated by the proliferation rate， and circular dichroism （CD） was used to detect the secondary structure of SFP. The results show that as the time of dialysis （12， 24， 36h） increased， Ca2+ content of SFP （16.00%， 9.60%， 0.40%） gradually decreased， and the growth of L02 changed from promotion to inhibition. Especially when the relative molecular mass of SFP was greater than 8kD， the cell proliferation rate of L02 decreased from （118.68%±3.65%） to （59.78%±1.70%）. In the secondary structure of the corresponding SFP， 3.43% of alpha-helix and 5.35% of irregular curl transformed to beta-folding. In the field of tissue engineering scaffolds， SFP with higher content of complex Ca2+ is more conducive to cell proliferation.

Key words： silk fibroin peptide; Ca2+ content; cell growth; relative molecular mass; secondary structure

收稿日期： 2018-07-05;

修回日期： 2019-01-10

基金項(xiàng)目： 重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2014jcyjA10018）

作者簡(jiǎn)介： 魏如男（1994），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锊牧?、功能高分子材料。通信作者：陳忠敏，教授，chenzhongmin@cqut.edu.cn

絲素蛋白（silk fibroin， SF）具有緩慢且可控的生物降解性，良好的生物相容性，能促進(jìn)多種細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)和增殖，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料[1]。支架材料中SF在體內(nèi)生理環(huán)境下主要通過酶解的方式降解為游離氨基酸和小分子的絲素肽（silk fibroin peptide， SFP）[2]，被細(xì)胞新陳代謝利用，對(duì)細(xì)胞增殖起到了提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用[3]，即SFP具有生長(zhǎng)因子相似的作用，作為生物材料呈現(xiàn)出較為優(yōu)秀的應(yīng)用價(jià)值。

但是，近年來有一些研究發(fā)現(xiàn)了絲素蛋白生物相容性方面有爭(zhēng)議的一面，如黃慧明等[4]研究發(fā)現(xiàn)SFP可抑制人胰腺癌細(xì)胞SW1990生長(zhǎng)，Yamada H等[5]發(fā)現(xiàn)SFP可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，在其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響方面兩者存在爭(zhēng)議。本課題組也發(fā)現(xiàn)SFP可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)，且存在濃度依賴性[6]，同時(shí)，將SFP應(yīng)用于肝臟組織工程支架中顯示，SFP有促進(jìn)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[7]。分析認(rèn)為：SFP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，而SFP由SF酶解獲得，是一種混合物，其結(jié)構(gòu)及其相對(duì)分子質(zhì)量大小分布因提取方式、處理（如溫度、pH值變化、有機(jī)溶劑處理、金屬離子作用及應(yīng)力作用等）存在較大差異，從而影響了其對(duì)細(xì)胞的作用。研究表明：隨著肽段分子鏈的加長(zhǎng)，絲素的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲減少，α螺旋增加[8]。SF極易受外界條件影響，二級(jí)結(jié)構(gòu)易由無規(guī)則卷曲向折疊結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變[9]，如甲醇可使SF中的無規(guī)則卷曲或Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)向β折疊轉(zhuǎn)變[10];pH值改變可致絲素蛋白從無規(guī)線團(tuán)到折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[11]。在采用CaCl2-乙醇-水三元體系再生SF時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Ca2+與SF分子內(nèi)部的氫鍵和范德華力等作用并將其破壞，與絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）側(cè)鏈羥基進(jìn)行配位形成螯合物，致分子構(gòu)象由β折疊向無規(guī)線團(tuán)轉(zhuǎn)變[12]，因此，Ca2+含量不同，SF二級(jí)結(jié)構(gòu)存在一定差異。

在SFP制備過程中會(huì)大量使用Ca2+，Ca2+可通過透析除去，SFP中Ca2+含量差異與透析時(shí)間相關(guān)。由于Ca2+絡(luò)合作用力和透析的滲透壓平衡，所得SFP中仍然存在一定含量的Ca2+，Ca2+含量與SFP的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性[13]，同時(shí)會(huì)影響酶切位點(diǎn)。因此Ca2+含量可能會(huì)影響SFP的相對(duì)分子質(zhì)量大小分布及其結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞作用存在差異。而相關(guān)研究尚未見報(bào)道，因此通過對(duì)透析時(shí)間的控制來獲得不同絡(luò)合Ca2+含量的SFP，利用卷式膜將其分為不同相對(duì)分子質(zhì)量級(jí)別，基于肝臟組織工程中有使用人正常肝細(xì)胞作為種子細(xì)胞的研究[14]。所以利用L02對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，并用圓二色譜（circular dichroism， CD）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，從而分析SFP絡(luò)合Ca2+改變SFP二級(jí)結(jié)構(gòu)后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料和試劑

繭殼（重慶市纖維織品檢驗(yàn)所），卷式膜小型實(shí)驗(yàn)機(jī)JM18812-1、卷式超濾膜元件PA-NF-1812，PA-NF8-1812，PES3-1812，PES8-1812（大連屹東膜工程設(shè)備有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（FORMA3111，美國Thermo公司），酶標(biāo)儀（Multiskan GO，美國Thermo公司），圓二色譜儀（英國APL Chiascan），透析袋（USA進(jìn)口分裝，標(biāo)定截留相對(duì)分子質(zhì)量MW為8000～14000），中性蛋白酶（酶活力20×104U/g，南寧龐博生物有限公司），人正常肝細(xì)胞L02（上海中喬新舟生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、HyClone（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、MTT（北京Solarbio生物科技有限公司），所用試劑Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、二甲亞砜（DMSO）、EDTA-2Na等均為分析純（市售）。

1.2不同相對(duì)分子質(zhì)量Ca2+-SFP的分級(jí)制備

選用中等級(jí)蠶繭除雜后，置于Na2CO3溶液（0.4mg/mL）沸煮2.5h，浴比1︰25，水洗干凈，烘干得到純絲素;將純絲素置于CaCl2-C2H5OH-H2O（摩爾比為1︰2︰8）三元體系溶液中于80℃溶解30min，冷卻至室溫，抽濾;將濾液置于透析袋中（截留相對(duì)分子質(zhì)量為8kD～14kD），每隔12h換一次蒸餾水，分別透析12、24h和36h，得到不同Ca2+濃度的絲素溶液;采用卷式膜實(shí)驗(yàn)機(jī)濃縮絲素溶液后，按照m純絲素︰m中性蛋白酶=20︰1在pH值為6.0～7.0條件下55℃水浴酶解1.5h;卷式膜實(shí)驗(yàn)機(jī)將絲素溶液分為2kD以下、2kD～3kD、3kD～5kD、5kD～8kD、8kD以上的不同相對(duì)分子質(zhì)量絲素溶液;真空冷凍干燥獲得各相對(duì)分子質(zhì)量Ca2+-SFP，密封保存?zhèn)溆肹15]。

1.3Ca2+含量檢測(cè)

采用GB/T7476—1987《水質(zhì)鈣的測(cè)定EDTA滴定法》，用移液管分別移取透析12、24、36h絲素蛋白溶液50.00mL，置于250mL錐形瓶中，再加入2mL10%氫氧化鈉溶液，搖勻后加鈣指示劑少許（約0.1g），用0.01mol/L EDTA-2Na溶液滴定至溶液由酒紅色變?yōu)榧兯{(lán)色，記錄EDTA-2Na溶液的用量，滴定3次取平均值。并按照下式計(jì)算Ca2+濃度：

X=C×V1×MV2×1000（1）

式中：X為水樣的鈣離子含量，mg/L;M為CaCO3的摩爾質(zhì)量，g/mol;C為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L;V1為滴定時(shí)消耗的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2為所取水樣的體積，mL。

1.4細(xì)胞生長(zhǎng)性能檢測(cè)

L02用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。用完全培養(yǎng)基配制質(zhì)量濃度為4mg/mL的SFP溶液，采用過濾除菌法（微孔濾器，220nm，Millipore，Ireland）處理后，再稀釋為質(zhì)量濃度2mg/mL和1mg/mL的SFP水溶液。待細(xì)胞生長(zhǎng)適宜后，用血球計(jì)數(shù)板將細(xì)胞濃度分別調(diào)整為3×104個(gè)/mL，以每孔100μL加入到96孔板（Corning，USA）中，過夜待細(xì)胞貼壁后，每孔加入100μL制備好的含不同質(zhì)量濃度的SFP培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加100μL完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)1、2、3、4、5d后每天采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性：每孔加20μL MTT溶液，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去96孔板中的液體，每孔加入100μL DMSO，使用酶標(biāo)儀震蕩10min，然后檢測(cè)其在490nm處的吸光值。并按照下式計(jì)算相對(duì)增殖率RGR：

RGR/%=實(shí)驗(yàn)組吸光值對(duì)照組吸光值×100（2）

1.5圓二色譜檢測(cè)

采用圓二色譜儀測(cè)試相對(duì)分子質(zhì)量8kD以上Ca2+含量為16.00%、9.60%、0.40%的SFP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)試條件為能帶寬度1nm，響應(yīng)1s，波長(zhǎng)190～260nm，掃描速度500nm/min。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析方法，以P<0.05判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1Ca2+含量檢測(cè)

采用水質(zhì)鈣的測(cè)定EDTA滴定法（表1），測(cè)得并計(jì)算得到透析12h的SFP中Ca2+含量為16.00%，透析24h的SFP中Ca2+含量為9.60%，透析36h的SFP中Ca2+含量為0.40%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，透析12、24、36h的SFP的Ca2+含量之間存在顯著性差異。在透析過程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與絲素蛋白質(zhì)中酪氨酸、絲氨酸等進(jìn)行配位絡(luò)合的Ca2+解離，然后沿濃度梯度擴(kuò)散透出透析袋，在不更換透析外液情況下，開始時(shí)Ca2+含量和透析袋內(nèi)外濃度差較大，前15h的Ca2+會(huì)快速解離，后期變化逐漸減小，30h后SFP中Ca2+含量趨于恒定[16]，但本實(shí)驗(yàn)中通過每隔12h更換透析外液，可使在透析36h時(shí)SFP中Ca2+幾近透出。

2.2各相對(duì)分子質(zhì)量級(jí)別SFP對(duì)L02生長(zhǎng)的影響

SFP溶液質(zhì)量濃度0.5mg/mL時(shí)（圖1），SFP中Ca2+含量為0.40%，RGR值隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增加而減小，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量大于8kD時(shí)，對(duì)L02的生長(zhǎng)呈較強(qiáng)抑制作用，RGR為（59.78%±0.70%），根據(jù)樣品毒性級(jí)別評(píng)分對(duì)照（表2）進(jìn)行細(xì)胞毒性級(jí)別評(píng)分[17]，細(xì)胞毒性級(jí)別為2級(jí)，其余相對(duì)分子質(zhì)量SFP的細(xì)胞毒性等級(jí)為1級(jí);Ca2+含量為9.60%時(shí)，所有相對(duì)分子質(zhì)量SFP對(duì)L02的生長(zhǎng)呈較弱抑制作用，細(xì)胞毒性等級(jí)均為1級(jí);Ca2+含量為16.00%時(shí)，所有相對(duì)分子質(zhì)量SFP對(duì)L02的生長(zhǎng)呈促進(jìn)作用，RGR均大于（117.45%±2.33%）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相同相對(duì)分子質(zhì)量大小的絡(luò)合不同Ca2+含量SFP對(duì)L02的RGR值均有顯著性差異。SFP細(xì)胞形態(tài)觀察（圖2）得知，SFP相對(duì)分子質(zhì)量大于8kD時(shí)，隨著Ca2+含量的減少，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，且在Ca2+含量0.40%時(shí)大量細(xì)胞發(fā)生變形，體積發(fā)生萎縮。綜上，說明SFP絡(luò)合Ca2+含量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在明顯差異。

2.3相對(duì)分子質(zhì)量8kD以上SFP二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定和分析

從SFP的相對(duì)分子質(zhì)量大小和Ca2+含量分析，相同相對(duì)分子質(zhì)量大小的SFP時(shí)，Ca2+含量不同對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同，可見SFP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響主要取決于Ca2+含量，且在SFP相對(duì)分子質(zhì)量8kD以上時(shí)尤為明顯。因此對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量8kD以上SFP進(jìn)行圓二色譜測(cè)定，得到圓二色譜圖（圖3），并用CONTIN程序及Yang-chen公式計(jì)算其各二級(jí)結(jié)構(gòu)成分。由表3所示，隨著Ca2+含量的升高，β折疊向α螺旋和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變，當(dāng)Ca2+含量從0.40%增加到16.00%時(shí)，β折疊的含量減少了8.54%，α螺旋和無規(guī)則卷曲的含量分別增加了3.43%和535%。

在絲素脫鹽過程中，隨著脫鹽率越高即鈣離子含量越低時(shí)，絲素蛋白分子構(gòu)象會(huì)由無規(guī)則卷曲向β折疊轉(zhuǎn)化[18]。且在絲素蛋白膜的制備中也有研究表明Ca2+含量為3.00%的絲素蛋白膜中β折疊含量比Ca2+含量為1.50%的絲素蛋白膜低[19]。因此，Ca2+在絲素蛋白鹽溶過程中改變了絲素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使無規(guī)則卷曲和α螺旋向β折疊轉(zhuǎn)變，從而使其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不同，隨著Ca2+含量減少，致β折疊含量增加，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)。有研究表明，α型絲素膜的多孔網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)更能夠適應(yīng)細(xì)胞的附著、鋪展，對(duì)增殖極為有利[8]。β淀粉樣蛋白對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有毒性作用，主要原因也是其結(jié)構(gòu)中α螺旋向β折疊的轉(zhuǎn)變[20]。故SFP中α螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的增殖有利，而β折疊含量較高則不利于細(xì)胞的增殖。

3結(jié)論

影響SFP對(duì)人正常肝細(xì)胞L02生長(zhǎng)的主要因素是Ca2+含量，而非相對(duì)分子質(zhì)量大小。SFP絡(luò)合較高Ca2+含量（16.00%）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而SFP絡(luò)合較低Ca2+含量（0.40%、 9.60%）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，在相對(duì)分子質(zhì)量8kD以上時(shí)尤為明顯。這是由于在SFP絡(luò)合Ca2+含量減少的過程中，其有較大的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，即無規(guī)則卷曲和α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B，α螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的增殖有利，而β折疊含量較高不利于細(xì)胞的增殖。綜上所述，在組織工程支架領(lǐng)域，建議使用絡(luò)合較高Ca2+含量（β折疊含量較少）的SFP更有利于細(xì)胞增殖。

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