劉薈婷 王繼綱 紀(jì)方方 高榆秀 付偉偉 趙鵬

[摘要]目的篩查肥厚型心肌病猝死者β-肌球蛋白重鏈（MYH7）基因的突變位點(diǎn)。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，對(duì)18例散發(fā)性肥厚型心肌?。ú±M）及20例非心肌?。▽?duì)照組）死者的甲醛固定心肌包埋組織，進(jìn)行MYH7基因部分外顯子片段擴(kuò)增，并進(jìn)行克隆法測(cè)序分析。利用Blast在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行突變位點(diǎn)物種間保守性分析。結(jié)果病例組中1例MYH7基因第14號(hào)外顯子發(fā)現(xiàn)Thr446Pro突變，1例第14號(hào)外顯子發(fā)現(xiàn)Phe468Leu突變，突變均位于MYH7基因的球狀頭部;對(duì)照組未見(jiàn)異常突變。物種間保守性分析顯示，Thr446和Phe468兩個(gè)氨基酸殘基在不同物種間高度保守。結(jié)論2例檢出MYH7基因突變位點(diǎn)者的病理組織纖維化程度較重，提示該兩個(gè)基因突變位點(diǎn)是導(dǎo)致肥厚型心肌病的惡性突變。

[關(guān)鍵詞]心肌病，肥厚性;心室肌球蛋白;DNA突變分析;法醫(yī)病理學(xué)

[中圖分類號(hào)]R542.2;R892[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2019）03-0330-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mutation sites in the MYH7 gene in patients with sudden death due to hypertrophic cardiomyopathy. MethodsFormalin-fixed paraffin-embedded myocardial samples were collected from 18 patients with sporadic hypertrophic cardiomyopathy （case group） and 20 patients without hypertrophic cardiomyopathy （control group）. PCR was used for the amplification of some exon fragments of the MYH7 gene， and the cloning method was used for sequencing. Blast online database was used to perform an interspecies conservation analysis of mutation sites. ResultsAmong the patients in the case group， one was found to have Thr446Pro mutation in exon 14 of the MYH7 gene and one was found to have Phe468Leu mutation in exon 14 of the MYH7 gene， and both mutation sites were located in the globular head of the MYH7 gene. No abnormal mutation was found in the control group. The interspecies conservation analysis revealed that the two amino acid residues of Thr446 and Phe468 were highly conserved among different species. ConclusionTwo patients with MYH7 gene mutations have a high degree of fibrosis in pathological tissue， suggesting that the two mutation sites are malignant mutations causing hypertrophic cardiomyopathy.

[KEY WORDS]cardiomyopathy， hypertrophic; ventricular myosins; DNA mutational analysis; forensic pathology

肥厚型心肌病（HCM）是心肌病中常見(jiàn)的一種常染色體顯性單基因遺傳病，是指排除導(dǎo)致心肌異常因素（如瓣膜病、高血壓）的原發(fā)性心肌病，以非對(duì)稱性心肌肥厚、左心室腔變小的心室壁肥厚或心臟質(zhì)量增加為特征 [1-2]。HCM是青少年及運(yùn)動(dòng)員發(fā)生心源性猝死（SCD）的首要原因[3]。SCD占成年人猝死的第1位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在SCD的病因中，遺傳性心肌病占5.9%～6.2%，位列第3位[4-5]。中國(guó)成年人群HCM的患病率為1/500，但由于我國(guó)是人口大國(guó)，HCM患病總數(shù)較為龐大，且該病遺傳度高，大約60%的成年HCM病人可檢測(cè)到明確的致病基因突變，對(duì)病人及其整個(gè)家族影響較大[6]。因此，HCM基因突變研究具有重要意義。到目前為止，已經(jīng)至少在27個(gè)基因突變中發(fā)現(xiàn)了1 600多個(gè)突變位點(diǎn)[7-8]。β-肌球蛋白重鏈（MYH7）基因是引起HCM的常見(jiàn)突變基因之一[9]。MYH7基因突變導(dǎo)致HCM的機(jī)制可能是因?yàn)樾氖壹∧芰抗?yīng)不足，從而引起心室肌或室間隔肥厚而致病[10-13]。HCM的致病突變方式分為家族性和散發(fā)性兩種。家族性HCM發(fā)病比較集中且呈家族聚集性，因此較好排查死亡的原因[14-15]。散發(fā)性HCM約占HCM的45%，因發(fā)病個(gè)體隨機(jī)，死因確定較困難，是法醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[16]。本研究對(duì)18例散發(fā)性HCM病人心肌MYH7基因的常見(jiàn)突變外顯子進(jìn)行測(cè)序分析，篩查基因突變位點(diǎn)，從而為HCM的預(yù)防、精準(zhǔn)治療及法醫(yī)明確死亡原因、確定死者身份提供理論依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

查閱青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科、青島市尸檢中心、青島市公安局刑警支隊(duì)技術(shù)處2006年1月—2017年12月的尸檢存檔資料，以法醫(yī)病理診斷為HCM（非高血壓性）的猝死病人18例為本研究病例組的研究對(duì)象。HCM的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：①心臟質(zhì)量增加1～2倍，成人平均心臟質(zhì)量>500 g;②室間隔顯著增厚，室間隔與左心室壁厚度比值>0.95，此為診斷HCM的主要指征;③組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為心肌纖維顯著肥大，排列紊亂呈漩渦狀或簇狀，細(xì)胞核大、深染，核形不一，可呈多形性畸形;心肌間質(zhì)內(nèi)小血管壁增厚，管腔狹窄;心肌間質(zhì)常有局灶性膠原纖維增生及纖維化改變。對(duì)照組20例為因暴力死亡的尸體解剖病例，已排除心臟肥大和心臟結(jié)構(gòu)性病變。本研究獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理道德委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2尸體解剖

所有研究對(duì)象均經(jīng)系統(tǒng)尸體解剖檢查，并取心、肝、脾、腎、肺、腦等主要器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3基因組DNA提取

用石蠟切片機(jī)（LEICA RM2235）切取研究對(duì)象的甲醛固定石蠟包埋組織，利用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒（TIANGEN，離心柱型）提取心臟標(biāo)本基因組DNA。

1.4聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及產(chǎn)物克隆

根據(jù)NCBI GenBank中的MYH7基因序列，應(yīng)用Primer blast引物設(shè)計(jì)軟件并根據(jù)含側(cè)翼內(nèi)含子序列進(jìn)行相應(yīng)外顯子引物設(shè)計(jì)（表1）。設(shè)計(jì)的引物由上海生物工程公司合成。所用PCR擴(kuò)增試劑為Premix TaqTM（EX TaqTM Version 2.0）。PCR反應(yīng)體系25 μL，其內(nèi)含有DNA模板2.0 μL，Premix 12.5 μL，上、下游引物各3 μmol/L，滅菌水4.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃、10 s，55～62 ℃、30 s，72 ℃、1 min，循環(huán)35次。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生物工程公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.5突變位點(diǎn)的確定及物種間保守性分析

運(yùn)用Chromas程序，根據(jù)NCBI、UCSC提供的正常人MYH7基因的基因組序列來(lái)分析測(cè)序結(jié)果，確定突變位點(diǎn)。利用Blast在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行突變位點(diǎn)物種間同源性比對(duì)，分析物種間保守性。

2結(jié)果

2.1法醫(yī)病理學(xué)檢查

本文18例散發(fā)性HCM猝死者中，男10例，女8例;年齡15～49歲，平均35歲。病例組心臟標(biāo)本尸檢特點(diǎn)均符合HCM診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中1例心臟質(zhì)量630 g，室間隔厚度/左心室壁厚度為1.38;1例心臟質(zhì)量494 g，室間隔厚度/左心室壁厚度為1.35。光鏡下這2例心肌組織切片蘇木精-伊紅染色主要表現(xiàn)為細(xì)胞核大、深染，細(xì)胞核形狀不一，可見(jiàn)多形性畸形，心肌纖維顯著肥大，排列紊亂呈漩渦狀或簇狀;Masson染色可見(jiàn)心肌間質(zhì)局灶性膠原纖維增生及心肌纖維化改變（圖1）。結(jié)合2例死者突然猝死的臨床表現(xiàn)，按照HCM的法醫(yī)病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，從組織病理學(xué)水平明確是由HCM導(dǎo)致的SCD。對(duì)照組心臟標(biāo)本大體觀察及組織學(xué)檢查均未見(jiàn)異常。

2.2基因組DNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析

在18例無(wú)血緣關(guān)系的中國(guó)漢族散發(fā)性HCM猝死者中，其 中1例發(fā)現(xiàn)NM_000257.2：c. 1336T>G（Thr446Pro）突變（rs796553039），即人類MYH7基因組第1336位堿基由T轉(zhuǎn)換成G，使遺傳密碼由TGG轉(zhuǎn)變成GGG，從而使其編碼的第446位蘇氨酸（Thr）轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼幔≒ro）（圖2A）;1例發(fā)現(xiàn)有NM_000257.2：c.1402T>C（Phe468Leu）突變（rs727504338），即人類MYH7基因組第1402位堿基由T轉(zhuǎn)換成C，使遺傳密碼由TTC轉(zhuǎn)變成CTC，從而使其編碼的第468位苯丙氨酸（Phe）轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔↙eu）（圖2B）。上述兩個(gè)突變均位于MYH7基因的球狀頭部。對(duì)照組病例均未發(fā)現(xiàn)MYH7基因突變。運(yùn)用BLAST在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)人、牛、猩猩、鼠、兔、狗、貓、豬的MYH7氨基酸序列進(jìn)行物種間保守性分析，結(jié)果顯示Thr446和Phe468兩個(gè)氨基酸殘基在物種間均高度保守。

3討論

本研究對(duì)MYH7基因的3、8、14、16～20、22、23、26、27號(hào)外顯子進(jìn)行檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)2例散發(fā)性HCM猝死者含有MYH7基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)，篩查到的Thr446Pro突變和Phe468Leu突變均為在國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的突變，且在ESP、OMIM、UCSC以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中均未發(fā)現(xiàn)此兩種核苷酸改變的報(bào)道。物種間保守性分析顯示，Thr446和Phe468兩個(gè)氨基酸殘基在不同物種間高度保守，其表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生缺陷，提示一旦發(fā)生突變將對(duì)生命活動(dòng)產(chǎn)生重要影響。而在對(duì)照組病例中均未發(fā)現(xiàn)這兩種突變。

檢測(cè)出錯(cuò)義突變的2例尸檢病例，其大體觀察可見(jiàn)心臟肥大，室間隔增厚、變硬，室間隔與左心室壁的厚度比值遠(yuǎn)大于0.95，蘇木精-伊紅染色可見(jiàn)細(xì)胞核大深染、呈多形性，Masson染色可見(jiàn)心肌間質(zhì)局灶性膠原纖維增生及心肌纖維化改變。心肌纖維化又稱為心肌鈣化，是指正常的心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原蛋白濃度明顯升高，出現(xiàn)膠原纖維的過(guò)量積聚或者膠原成分發(fā)生明顯改變。高血壓所致心肌肥厚的心肌纖維化程度遠(yuǎn)低于HCM病人的心肌纖維化程度，故心肌纖維化改變是HCM病人典型的原發(fā)性病理學(xué)改變[17]。心肌細(xì)胞為不可再生細(xì)胞，一旦發(fā)生纖維組織增生，室間隔就會(huì)增厚、變硬，使心室充盈受限和舒張容量下降，導(dǎo)致心臟供血功能障礙，最終導(dǎo)致猝死的發(fā)生。

MYH7基因是第一個(gè)被確定為引起HCM的致病基因，也是HCM最常見(jiàn)的致病基因之一[18-20]。編碼MYH7基因外顯子全長(zhǎng)5 808 bp，位于染色體14q12，共含有40個(gè)外顯子，其中頭部由第3～21號(hào)外顯子形成，頸部由第21～25號(hào)外顯子形成（又稱為頭-桿接合部），第25～40號(hào)外顯子則形成桿部。MYH7基因發(fā)生突變具有聚集性，好發(fā)于頭部及頭-桿接合部，其他部位突變發(fā)現(xiàn)較少[21-23]。

本研究發(fā)現(xiàn)的Thr446Pro和Phe468Leu錯(cuò)義突變均發(fā)生于第14號(hào)外顯子，位于MYH7基因的球狀頭部。WALSH等[23]的研究總結(jié)了MYH7突變導(dǎo)致HCM的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)果顯示，MYH7突變中有229種為錯(cuò)義突變，占突變總數(shù)（238種）的96%;大部分致病基因突變發(fā)生在MYH7基因的球狀頭部與頸部，頭部和頸部發(fā)生的突變所致的相關(guān)疾病表型較桿部區(qū)域突變更加嚴(yán)重，這些突變集中在第5～8、13～16和19～23號(hào)外顯子，編碼肌球蛋白發(fā)揮功能的關(guān)鍵區(qū)域、肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)、肌球蛋白重鏈與輕鏈結(jié)合位點(diǎn)、核苷酸連接位點(diǎn)及兩個(gè)活性半胱氨酸連接區(qū)，突變后外顯率和猝死率均較高[24]。其中，第14號(hào)外顯子編碼的MYH7兩個(gè)半胱氨酸的連接區(qū)域，是球狀頭部的重要功能區(qū)。發(fā)生在此區(qū)域的突變還有Arg453Cys、Gly425Arg和Thr441Met，其臨床外顯率較高[25-27]，推測(cè)其致病機(jī)制可能是該區(qū)域發(fā)生的突變可使肌球蛋白S1區(qū)的ATP酶活性增強(qiáng)，阻礙了肌球蛋白構(gòu)象的改變或者使其與肌動(dòng)蛋白及其他分子之間的相互作用發(fā)生了改變，最終導(dǎo)致HCM的發(fā)生，表現(xiàn)為高外顯率、進(jìn)展快、易致心力衰竭等惡性臨床表現(xiàn)[23]。結(jié)合上述研究，我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)突變位點(diǎn)造成氨基酸的改變不是單核苷酸多態(tài)性，而是HCM的致病突變。

HCM的臨床診斷是基于對(duì)心臟肥大的檢測(cè)，它既不特異也不敏感，DNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)則為HCM的診斷提供了新的方向，特別是在早期診斷和獨(dú)立的臨床表型方面[20，28]?；蚝Y查中僅有一半的概率能夠檢測(cè)到突變基因，這表明仍然有很多與HCM相關(guān)的突變基因未被識(shí)別。先證者有時(shí)可能攜帶兩個(gè)致病的突變，但基因篩查僅篩查出其中一個(gè)，或者基因突變是從頭突變，這樣會(huì)影響到基因檢測(cè)的結(jié)果。因此，需要進(jìn)行大樣本的基因檢測(cè)與臨床表型分析，為HCM防治策略的制定提供充分的依據(jù)[29]。

在法醫(yī)學(xué)中，大部分SCD案例通過(guò)尸體解剖、組織病理學(xué)檢查可以明確死因?yàn)樾脑葱约膊?，尚有少?shù)案例雖經(jīng)詳細(xì)檢驗(yàn)并高度懷疑為SCD，但仍不能明確死因是心臟疾病。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)此類猝死者中有相當(dāng)一部分為HCM所致，因此，研究HCM基因突變位點(diǎn)，可以為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中SCD原因的鑒定提供指導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)的MYH7基因Thr446Pro和Phe468Leu突變是國(guó)內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)的，可以引起HCM。散發(fā)性HCM也應(yīng)警惕其將突變傳遞給下一代的風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)散發(fā)性HCM病人進(jìn)行家系排查同樣具有重要意義?；驒z測(cè)有助于HCM的診斷，不僅能為法醫(yī)學(xué)明確死亡原因，還能提高猝死的防治水平。

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（本文編輯 馬偉平）