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摘要?目的：觀察蜂毒素對博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的干預(yù)作用。方法：70只SPF級C57BL/6小鼠被隨機分為正常組10只和模型組、地塞米松組、蜂毒素低劑量組、蜂毒素中劑量組、蜂毒素高劑量組各12只。除正常組外，均采用氣管穿刺注入博萊霉素（BLM）制備肺纖維化小鼠模型。從術(shù)后第1天開始，地塞米松組按3 mg/kg的劑量腹腔注射，蜂毒素低、中、高劑量組分別給予5 μg/（kg·d）、10 μg/（kg·d）、20 μg/（kg·d），對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。分別于第7、第14天處死動物，收集小鼠外周血樣本，通過ELISA方法檢測血清轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、膠原蛋白I（CollagenI）、膠原蛋白III（CollagenIII）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的水平。取肺組織進行蘇木精-伊紅（HE）分析，Masson染色和羥脯氨酸（HYP）評估以觀察組織病理學(xué)變化和膠原沉積。采用實時熒光定量（Real-ime PCR）法和蛋白兔疫印跡法（Western blot）觀察各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3等蛋白和基因的表達變化。結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠肺纖維化明顯，HYP、TGF-β1、CollagenI、CollagenI的含量升高（P<0.05），肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和基因表達升高（P<0.05）;與模型組比較，蜂毒素中高劑量組血清HYP、TGF-β1、CollagenI、CollagenI的含量下降（P<0.05），肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和基因表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：蜂毒素可以減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的程度，其機制可能與抑制TGF-β1/Smads通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞?蜂毒素;抑制;博萊霉素;小鼠;肺纖維化;機制;TGF-β1/Smads通路;羥脯氨酸

Study on the Mechanism of Melittin Inhibiting Pulmonary Fibrosis Induced by Bleomycin in Rats

Li Li，Wei Lei，Wang Zhongfu，Zhang Xiulian，Qian Yechang

（1 Baoshan Branch，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201900，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of melittin on inhibiting pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats. Methods：Seventy SPF grade C57BL/6 rats were randomly divided into the normal group（n=10）and the model group，dexamethasone group and melittin low dose group，melittin middle dose group and melittin high dose group（n=12）. In addition to the normal group，a rat model of pulmonary fibrosis was prepared by injecting bleomycin（BLM）into the trachea. From the first day after surgery，the dexamethasone group was intraperitoneally injected at a dose of 3 mg/kg，while the low，medium and high doses of melittin were administered to 5，10，and 20 μg/（kg·d） respectively. The control group and the model group were given an equal volume of saline for 2 weeks. The animals were sacrificed on the 7th and 14th day，respectively，peripheral blood samples of which were collected. ELISA was used to detect serum transforming growth factor（TGF-β1），collagen I（Collagen I），collagen III（Collagen III），and matrix metalloproteinase 2（MMP2）and the level of matrix metalloproteinase 9（MMP9）. Lung tissue was taken for hematoxylin-eosin（HE）analysis，Masson staining and hydroxyproline（HYP）evaluation to observe histopathological changes and collagen deposition. The expressions of TGF-β1，Smad2，Smad3 and other proteins and genes in lung tissue of each group were observed by Real-time PCR and Western blot. Results：Compared with the control group，the pulmonary fibrosis was significantly increased in the model group. The contents of HYP，TGF-β1，Collagen I and Collagen I were increased（P<0.05），and the expression of TGF-β1，Smad2，Smad3 protein and gene in lung tissue was increased（P<0.05）; Compared with the model group，the levels of serum HYP，TGF-β1，Collagen I，CollagenI in the high dose group of melittin decreased（P<0.05），and TGF-β1，Smad2，Smad3 protein in lung tissue and gene expression was decreased（P<0.05）. There was no statistically significant difference in the low-dose group. Conclusion：Melittin can effectively reduce the degeneration of pulmonary fibrosis induced by bleomycin，and its mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smads pathway.

Key Words?Melittin; Inhibition; Bleomycin; Pulmonary fibrosis; Mechanism; TGF-β1/Smads pathway; Hydroxyproline

中圖分類號：R563;R256文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.018

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是一種進行性加重的肺間質(zhì)疾病，以限制性通氣功能障礙、進行性彌漫性肺間質(zhì)纖維化為特征，最終可導(dǎo)致呼吸衰竭，預(yù)后極差[1]。目前治療手段有限[2-3]。在參與肺損傷纖維化的細胞因子網(wǎng)絡(luò)中，轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming Growth Factor-，TGF-β1）是最重要的細胞因子[4-6]，也是PF發(fā)生中重要的刺激信號[7]。TGF-β1可使肺成纖維細胞發(fā)生過度增殖和分化[8]，也是目前已知最強的細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）沉積促進劑[9]。TGF-β/Smads是研究PF最多的一條通路，通過Smad3信號過度表達引起纖維増生性疾病和纖維化[10]，而PF的形成與Smad2、Smad3蛋白表達有緊密聯(lián)系[11]。間質(zhì)型膠原（collagenⅠ型、Ⅲ型）在肺內(nèi)廣泛分布，在PE的形成過程中也占有重要地位[12]。基質(zhì)金屬蛋白（Matrixmetallo Proteinases，MMPS）屬于蛋白酶家族，是降解細胞外基質(zhì)最重要的家族，研究發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9可參與TGF-β1的激活，TGF-β1也可調(diào)節(jié)MMPS、TIMPS的表達[13]。

中醫(yī)學(xué)對PF并無特定病名，但根據(jù)其致病因素、臨床表現(xiàn)，多歸屬于“肺痿”“肺痹”等病證范疇。本病責(zé)之肺腎氣虛，邪氣入中，久留肺絡(luò)，氣血因瘀而滯，肺絡(luò)因痹而痿，故氣虛血瘀是PF的主要病機，益氣活血法是治其之基本大法。蜂毒是工蜂毒腺分泌的一種成分復(fù)雜的化合物，主要成分包括蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大細胞脫粒肽、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶等多種活性物質(zhì)，均具有廣泛的藥理學(xué)作用。蜂毒肽（melittin）是蜂毒中的主要功能物質(zhì)，是由26個氨基酸殘基組成的多肽，約占蜂毒干重的50%，可以抗血小板聚集，延長小鼠體外凝血時間，有很強的抗凝作用，因而具有活血化瘀之顯著功效[14]。同時作為一種細胞毒類的藥物，因其分子小、穩(wěn)定性高，而具有消炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)以及促進腎上腺皮質(zhì)激素分泌等多種功效[15]。本研究通過博萊霉素構(gòu)造小鼠PF模型，分別予以蜂毒素及地塞米松進行干預(yù)，旨在觀察蜂毒素對PF的影響及其作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?4～5周齡的健康SPF級C57BL/6雌性小鼠共72只，每只體質(zhì)量20 g左右，購買于上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號：20130016005315，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。實驗時間：2017年7月至2018年12月，實驗動物飼養(yǎng)條件為：溫度21～24 ℃，濕度約為50%，光照與否循環(huán)時間為12 h，滅菌飼料和飲用水由動物中心統(tǒng)一提供并由飼養(yǎng)者自行取用。

1.1.2?藥物?博萊霉素（日本，日本化藥株式會社，生產(chǎn)批號：H20055883）;蜂毒素（阿拉丁生物公司，生產(chǎn)批號：Lot#：H1801124）。

1.1.3?試劑與儀器?RNA試劑盒（日本，Takara bio inc公司，批號：RR420A）、HYP試劑盒（美國，Sigma-Aldrich公司，批號：MAK008-1KT）;兔抗GAPDH多克隆抗體（美國，Cell Signaling Technology公司，批號：5174S），兔抗TGF-β1單克隆抗體（美國，Cell Signaling Technology公司，批號：3711S）;兔抗Smad2多克隆抗體（美國，Cell Signaling Technology公司，批號：8685S），兔抗Smad3單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bsm-52224R），兔抗p-Smad2多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-2224R），兔抗p-Smad3多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-3425R）。PCR擴增儀（美國，伯樂，批號：MSMZ120004）;酶標(biāo)（美國，寶特，批號：EXL-808）;低溫離心機（德國，艾本德，批號：SIGMA 3-30KS）;凝膠數(shù)碼成像系統(tǒng)（上海天能，批號：Tanon 4100）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后，隨機分為6組：正常組（NS）10只;模型組、地塞米松組、蜂毒素低劑量組、蜂毒素中劑量組、蜂毒素高劑量組各12只，每組分別在術(shù)后第7天、第14天進行檢測。每個時間點6只。除NS組外，余各組以1.5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定，將小鼠仰臥固定于實驗臺，固定頭和四肢，常規(guī)消毒，沿頸部正中線作一切口，鈍性分離各層組織，暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向氣管內(nèi)緩慢注入博萊霉素生理鹽水溶液（5 mg/kg）0.2～0.3 mL，注射后迅速將小鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布[16]。將動物置于干燥、溫暖條件下喂養(yǎng)，定期對喂養(yǎng)場所消毒。

1.2.2?給藥方法?模型建立24 h后腹腔注射干預(yù)藥物，1次/d，依據(jù)小鼠與人藥物劑量折算方法[17]，計算蜂毒素低、中、高劑量組分別給予5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg，地塞米松組為地塞米松3 mg/kg，模型組和假手術(shù)（NS）組在相同條件下向氣管內(nèi)注入等容量生理鹽水;蜂毒素處理組分別腹腔注射5 μg/（kg·d）、10 μg/（kg·d）、20 μg/（kg·d）的蜂毒素干預(yù)處理;地塞米松處理組腹腔注射3 mg/（kg·d）的地塞米松。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1?在第14天，收集所有小鼠的肺組織4%多聚甲醛內(nèi)固定12 h，梯度乙醇脫水，包埋切片，采用蘇木精伊紅染色法（HE）光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)改變。此外，進行Masson三色染色以測量膠原纖維的密度。通過炎性細胞的浸潤，肺泡壁的厚度以及膠原沉積的嚴重程度來評估PF的程度。

1.2.3.2?羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）含量測定?右肺組織液氮保存，取肺組織勻漿進行羥脯氨酸含量測定，以檢測肺組織膠原沉積情況，操作嚴格按照說明書進行。

1.2.3.3?ELISA檢測TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9含量?留取小鼠血清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9，抗小鼠TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9單克隆抗體（單抗）包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品及肺組織中的TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9與其單抗結(jié)合，室溫孵育2 h后洗滌5次，洗去未結(jié)合物;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9，與結(jié)合在單抗上的TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9形成免疫復(fù)合物，室溫孵育2 h后洗滌5次;加入顯色劑，室溫避光30 min，若反應(yīng)孔中有上述細胞因子存在（呈藍色），則加入反應(yīng)終止液后變?yōu)辄S色。在波長450 nm處測定吸光度（A）值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出肺組織中TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9的濃度。

1.2.3.4?實時熒光定量（Real-time PCR）法檢測TGF-β1、Smad2/3 mRNA的表達?按照以下[18]的方法提取肺組織總RNA，用勻漿機把肺組織研成懸液，加入0.2 mL氯仿，離心12 000 r/min，4 ℃，15 min，取上清，再加入異丙醇，混勻、離心，棄上清，用無水乙醇清洗，再加入DEPC水測RNA濃度（ng/μL），再進行反轉(zhuǎn)錄，按照說明書進行PCR。

1.2.3.5?蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測肺組織中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達情況?取大約500 mg肺組織，加1 mL RIPA裂解液使其組織充分裂解。充分裂解組織后，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液體，測蛋白濃度測定，根據(jù)測得的各樣品蛋白濃度，從不同樣品中分別取40 μg蛋白，用PBS補足體積至20 μL，再加入4 μL的5×上樣緩沖液，混勻，離心4 ℃，12 000 r/min，30 s，100 ℃水浴鍋變性10 min，冷卻，4 ℃ 12 000 r/min離心30 s。進行電泳、轉(zhuǎn)膜，再進行封閉，加入足量的封閉液（5%BSA溶液：1 g BSA：20 mL PBST）封閉，室溫緩慢平搖1～2 h。孵育一抗（1∶250），緩慢平搖孵育，4 ℃過夜。次日以1×PBST液漂洗，再加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫振搖1 h1×PBST液漂洗，DAB顯色，然后用蒸餾水洗膜。每組取5個樣本納入統(tǒng)計。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?蜂毒素能有效減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理學(xué)變化?通過HE和Masson染色分析小鼠肺組織病理學(xué)改變。模型組小鼠第7天表現(xiàn)為肺泡間隔增寬，肺泡腔、肺間質(zhì)內(nèi)有大量的多核及單核細胞浸潤，第14天時肺泡炎性反應(yīng)較前有所減輕，但成纖維細胞增生明顯，膠原蛋白沉積在新生的毛細血管周圍，肺泡間隔增寬，肺泡結(jié)構(gòu)萎陷，肺泡腔被膠原蛋白及成纖維細胞填充。蜂毒低劑量組干預(yù)后與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。單純的地塞米松組和蜂毒素中劑量組分別干預(yù)后，肺泡炎性反應(yīng)和膠原蛋白沉積程度均較同一時間點的模型組有所減輕。而蜂毒素高劑量組能夠明顯減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺組織纖維化程度。見圖1、2。

2.2?蜂毒素組可有效減少膠原沉積和羥脯氨酸含量?單純地塞米松組和蜂毒中劑量組分別干預(yù)后，第14天測定肺組織羥脯氨酸含量有所降低，這與Masson染色結(jié)果相對應(yīng)。蜂毒高劑量組HYP含量在第14天降低更為明顯，基本達到與正常對照組相接近的水平。見圖3。

2.3?蜂毒素可有效降低纖維發(fā)生相關(guān)細胞因子的水平?在第7天、第14天用ELISA評估小鼠血清中TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9的含量。我們發(fā)現(xiàn)模型組各時間點TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9的含量明顯升高。蜂毒低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而地塞米松組、蜂毒中、高劑量組同一時間點各細胞因子含量均明顯降低。見圖4。

2.4?蜂毒素對肺組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達的影響?與對照組比較，模型組小鼠TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA在第14天時表達顯著升高（P<0.01）;蜂毒素低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較蜂毒素中劑量組Smad3 mRNA表達降低（P<0.01），蜂毒素高劑量組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達明顯降低（P<0.001），地塞米松組TGF-β1、Smad3 mRNA表達均明顯降低（P<0.05）。見圖5。

2.5?蜂毒素對肺組織中TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3蛋白表達的影響?在第7天、第14天與對照組比較，模型組小鼠TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3蛋白表達顯著升高（P<0.01）;蜂毒素低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），蜂毒素中劑量組P-Smad2/3蛋白表達降低（P<0.01），蜂毒素高劑量組TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表達明顯降低（P<0.001）;地塞米松組TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。見圖6。

3?討論

PF的病理變化包括細胞外基質(zhì)過度沉積、間質(zhì)慢性炎性反應(yīng)、成纖維細胞增殖和肺泡結(jié)構(gòu)塌陷等[19-20]。國內(nèi)外研究表明，細胞因子在纖維化疾病中扮演了至關(guān)重要的角色，特別是TGF-β1作為關(guān)鍵的上游致纖維化因子，具有多種生物學(xué)功能，能使成纖維細胞活化，膠原合成增加、ECM過度沉積而致纖維化[21-22]。Smads蛋白作為TGF-β家族的特異性細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可以激活TGF-β，使Smad2和Smad3磷酸化[23]，其表達與PF的形成直接相關(guān)[24]。Sriram[25]等研究博來霉素誘導(dǎo)PF大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和Smad3在PF大鼠體內(nèi)顯著表達，ECM沉積明顯，給藥后TGF-β1、Smad3以及膠原表達均顯著降低。積聚在肺間質(zhì)中的膠原，主要以Ⅰ型和Ⅲ型膠原為主[26]。纖維細胞分泌幾種MMP，包括MMP-2，MMP-7，MMP-8和MMP-9[27]。MMP-9和MMP-2它們的主要結(jié)構(gòu)和底物具有特異性[28]。最近研究發(fā)現(xiàn)[29]MMPS具有多種生物學(xué)功能，其中MMP-2和MMP-9的抑制顯著減弱了纖維細胞遷移和沉積。因此抑制膠原的合成與沉積，可以有效減輕PF。

纖維化可發(fā)生于各部位及多器官，引起組織器官內(nèi)纖維結(jié)締組織（硬結(jié)）增多，而研究[30]蜂針能消除纖維化結(jié)節(jié)?？Х人岜揭阴ィ–affeic Acid Phenethyl Ester，CAPE）是一種天然的黃酮類化合物，是蜂膠中的主要成分。CAPE具有抗氧化、抗炎、抗癌，抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的特性，已應(yīng)用于多種疾病模型。劉瑞等[31]研究蜂膠提取物CAPE對大鼠PF的干預(yù)作用，結(jié)果顯示肺組織纖維化程度，與BLM組比較，地塞米松（DEX）與CAPE聯(lián)合觀察組PF程度最弱，并且羥脯氨酸含量明顯減低。辛紹杰[32]等觀察蜂毒對144只大鼠實驗性肝纖維化的療效，結(jié)果表明觀察組在肝纖維化完全形成后再給藥，治療3個月后發(fā)現(xiàn)，Ⅰ-Ⅲ級纖維化分別占54.5%和66.7%，明顯輕于模型組。PARK等[33]研究結(jié)果顯示蜂毒肽對于抑制肝臟炎性反應(yīng)和纖維化有一定的效果，并且進一步[34]證明蜂毒肽是通過使cspase和基因蛋白bax的表達降低，以及體內(nèi)細胞色素C的釋放，使肝臟不受到損害。

我國擁有非常豐富的蜂毒資源，但對于蜂毒藥理以及臨床應(yīng)用的研究、開發(fā)和利用目前還不夠深入，故針對該方面的研究具有廣闊的前景。本研究結(jié)果顯示，小鼠在給予一次性氣管穿刺注入博萊霉素后，運用蜂毒素進行干預(yù)，經(jīng)過7 d和14 d，通過HE和Masson染色所見肺組織纖維化及膠原沉積程度明顯較模型組減輕，且羥脯氨酸（HYP）含量亦有明顯降低，且與地塞米松組無明顯差異，說明蜂毒素可以有效抑制BLM誘導(dǎo)的小鼠肺組織纖維化程度。通過地塞米松組或蜂毒素中、高劑量單獨干預(yù)后發(fā)現(xiàn)血清中TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9含量均有明顯減少，同時小鼠肺組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達較模型組顯著降低，說明蜂毒素可從基因和蛋白水平上減輕PF，其作用機制可能與抑制TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

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