崔麗霞　孫麗萍　趙丕文　劉欣　石丹寧　陳夢(mèng)

〔摘要〕 目的 探討羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A， HSYA）對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞EC-304，用H2O2構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，分別設(shè)置正常對(duì)照組、H2O2損傷模型組、HSYA藥物組，其中各藥物組用不同濃度的HSYA預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后加入50 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力，用試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的含量，用Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與H2O2模型組相比，HSYA能顯著提高細(xì)胞存活率，且呈劑量依賴(lài)性，提高細(xì)胞內(nèi)SOD的活性，提高細(xì)胞內(nèi)NO的含量，降低Bax表達(dá)，提高 Bcl-2表達(dá)，降低Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達(dá)（P<0.01或P<0.05）。

結(jié)論 HSYA對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，其可能的作用機(jī)制與抑制EC-304細(xì)胞凋亡相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 羥基紅花黃色素A;血管內(nèi)皮細(xì)胞;氧化應(yīng)激損傷;細(xì)胞凋亡

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.009

Protective Mechanism of Hydroxysafflor Yellow A on Vascular Endothelial Cells Injured by Oxidative Stress

CUI Lixia1， SUN Liping1， ZHAO Piwen1， LIU Xin2， SHI Danning1， CHEN Meng1*

（1. Beijing University of Chinese Medcine， Beijing 102488， China; 2. The Third Affiliated Hospital of

Beijing Univesity of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

〔Abstract〕 Objective To study the protective mechanism of hydroxysafflor yellow A （HSYA） on vascular endothelial cells injured by oxidative stress. Methods EC-304 human vascular endothelial cells were cultured in vitro. An oxidative stress injury model was established with H2O2. The cells were divided into several groups， namely control group， H2O2 injury model group， and HSYA groups. The cells in HSYA groups were pre-cultured with different concentrations of HSYA for 24 h， followed by addition of 50 μmol/L H2O2， and the cells were then cultured for another 12 h. Cell proliferation activity was determined by MTT assay， the content of superoxide dismutase （SOD） and nitric oxide （NO） was measured by kits， and the protein expression levels of Bax， Bcl-2， Caspase-3， and cleaved Caspase-3 were determined by Western Blot. Results Compared with the H2O2 model group， HSYA significantly increased the cell survival rate in a dose-dependent manner， and it significantly increased SOD activity， NO content， and Bcl-2 expression and significantly reduced the expression of Bax， Caspase-3， and cleaved Caspase-3 （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion HSYA has a protective effect on H2O2-induced oxidative stress injury of vascular endothelial cells， and the mechanism is possibly related to inhibition of the apoptosis of EC-304 cells.

〔Keywords〕 hydroxysafflor yellow A; vascular endothelial cell; oxidative stress injury; apoptosis

血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯于血管內(nèi)壁的單層扁平上皮細(xì)胞，在人體內(nèi)具有吞噬異物、分泌生長(zhǎng)因子、參與血管形成、調(diào)節(jié)血管張力、凝血、纖溶等多種生理功能，保證心血管系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是造成高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的因素，而氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡又是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要原因[1]，因此，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞功能，對(duì)于治療心血管疾病具有重要臨床意義。

紅花是活血通經(jīng)、祛瘀止痛的中藥，羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A， HSYA） 是紅花的主要活性成分，具有查爾酮類(lèi)結(jié)構(gòu)，有抗炎、抗腫瘤、治療婦科疾病等多種藥理作用，本課題組前期對(duì)于HSYA的雌激素樣作用也進(jìn)行了相關(guān)研究[2]。本實(shí)驗(yàn)選取人血管內(nèi)皮細(xì)胞EC-304為研究對(duì)象，在體外用H2O2處理制備氧化應(yīng)激損傷模型，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，探討HSYA對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 細(xì)胞株? 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（EC-304）購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2? 藥物? HSYA購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，實(shí)驗(yàn)時(shí)用二甲基亞砜（DMSO）溶解至所需濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3? 主要試劑? 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）;胎牛血清FBS（Hyclone公司）;0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）;PBS緩沖液（Solarbio公司）;H2O2（Amresco公司）;DMSO（Sigma公司）;四甲基偶氮唑藍(lán)MTT（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）;SOD試劑盒、NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司）;一抗：Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3（Abcam公司）;二抗：Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）;蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）;顯影液、定影液（天津市世紀(jì)奧博公司）。

1.1.4? 主要儀器? VS-1300L-U超凈臺(tái)（日本AIRTECH公司）;MC0-18AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）;TS100普通倒置顯微鏡（日本NIKON公司）;SAFIREⅡBASIC多功能熒光酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）;3K15低溫高速離心機(jī)（美國(guó)SIGMA公司）;WD-9405B水平搖床（北京六一儀器廠(chǎng)）;DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）;Mini-PROTEAN Tetra Cell單垂直電泳槽、Mini-PROTEAN Ⅱ轉(zhuǎn)移電泳槽（BIO-RAD公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)? 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)EC-304細(xì)胞。傳代3次以上，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2? H2O2損傷模型的構(gòu)建? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EC-304細(xì)胞，用0.25%胰酶消化5 min，制成細(xì)胞混懸液，以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，以含H2O2終濃度分別為50、100、200、400、800 μmol/L的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后測(cè)定490 nm處吸光度值，選取合適的H2O2造模濃度，構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。

1.2.3? MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EC-304細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L的HSYA，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（無(wú)任何處理）和H2O2模型組（50 μmol/L H2O2），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)12、24、36 h后，吸棄對(duì)照組的培養(yǎng)液，再加入100 μL的完全培養(yǎng)基繼續(xù)作用12 h。吸棄模型組和各藥物組的培養(yǎng)液，加入100 μL含H2O2終濃度均為50 μmol/L的培養(yǎng)基繼續(xù)作用12 h。終止培養(yǎng)，用PBS緩沖液清洗。向各孔加入MTT 100 μL，于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，在搖床上震蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定各組在490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的增殖率。

細(xì)胞增殖率=（受試物的平均OD值/對(duì)照組的平均OD值）×100%

1.2.4? Wst-1法測(cè)定細(xì)胞SOD含量? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EC-304細(xì)胞，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗，加胰酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞混懸液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，將離心管置于冰上。加入預(yù)冷的裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），不斷混勻，待細(xì)胞完全裂解后，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，吸取上清液。按照說(shuō)明書(shū)，在96孔板中操作，設(shè)置對(duì)照組、對(duì)照空白組、測(cè)定組和測(cè)定空白組，其中測(cè)定孔與測(cè)定空白孔又包括正常對(duì)照組、模型組和不同濃度HSYA組。置于水平搖床37 ℃孵育20 min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度值。

1.2.5? 一步法測(cè)定細(xì)胞NO含量? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EC-304細(xì)胞，收集細(xì)胞混懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液清洗2次，加入200 μL PBS緩沖液，冰水浴條件下超聲破碎，制備好勻漿液。在96孔板中操作，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔，空白孔加入雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)孔加入亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定孔中加入各組經(jīng)處理的細(xì)胞上清液（勻漿液300 μL加試劑一200 μL，渦旋充分混勻后靜置10 min，4 000 r/min離心15 min，吸上清），分別加入顯色劑反應(yīng)，靜置15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處的各孔吸光度值。

NO含量（μmol/L）=■×

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（20 μmol/L）×稀釋倍數(shù)

1.2.6? Western Blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗，加胰酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞混懸液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，將離心管置于冰上。加入預(yù)冷的蛋白裂解液，不斷混勻，待細(xì)胞完全裂解后，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，吸取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)蛋白含量。用上樣緩沖液調(diào)節(jié)蛋白樣品，加熱變性后，迅速入冰冷卻。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，80 V恒壓電泳1 h，待條帶跑至濃縮膠與分離膠的交界處時(shí)，電壓換為120 V。120 V恒壓濕法轉(zhuǎn)膜75 min，室溫下封閉1 h。加入一抗（β-actin 1∶15 000，Bax 1∶1 000，Bcl-2 1∶2 000，Caspase-3 1∶5 000，cleaved Caspase-3 1∶3 000）后于4 ℃冰箱中過(guò)夜，次日洗去一抗，孵育二抗（二抗1∶5 000），滴加ECL發(fā)光液后顯影定影。用Image J軟件分析結(jié)果。

1.2.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分析及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊，采用單因素方差分析ANOVA檢驗(yàn)，組間比較用LSD（L）;不符合正態(tài)分布和方差齊的，用非參數(shù)檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)均用“x±s”表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? H2O2對(duì)細(xì)胞活力的影響

如表1所示，與正常對(duì)照組相比，50 μmol/L的 H2O2可顯著抑制細(xì)胞增殖（P<0.01）。由于100 μmol/L至更高劑量的H2O2對(duì)細(xì)胞抑制率過(guò)大，易產(chǎn)生細(xì)胞毒性（如圖1所示），因此，選擇50 μmol/L 的H2O2作用12 h作為EC-304細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷造模條件。

2.2? HSYA對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響

如表2所示，在24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，模型組中細(xì)胞增殖率顯著下降（P<0.01）;與模型組相比，各藥物組細(xì)胞增殖率均顯著提高（P<0.01），且HSYA濃度越高，效果越顯著，呈劑量依賴(lài)性。在12 h和36 h時(shí)，與模型組相比，高濃度的HSYA（1×10-5 mol/L）促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最顯著（P<0.01），HSYA（1×10-6、1×10-7 mol/L）對(duì)細(xì)胞也有促進(jìn)作用（P<0.05）。

2.3? HSYA對(duì)細(xì)胞SOD含量的影響

如表3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組SOD含量明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組相比，HSYA濃度為1×10-5 mol/L時(shí)，SOD含量明顯高于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4? HSYA對(duì)細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響

如表4所示，與正常組相比，模型組中NO的含量明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，HSYA濃度為1×10-5 mol/L時(shí)，NO的含量明顯高于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.5? HSYA對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響

如圖2-3所示，加入HSYA預(yù)處理后，與模型組相比，Bax的表達(dá)量和Bax/Bcl-2的比值顯著降低（P<0.01），Bcl-2的表達(dá)量顯著升高（P<0.01），且HSYA劑量越高，效果越明顯，呈劑量依賴(lài)性。藥物組與模型組相比，Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達(dá)含量顯著降低（P<0.01），且HSYA劑量越高，效果越明顯，呈劑量依賴(lài)性。

3 討論

活性氧自由基引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是誘發(fā)多種心血管疾病的病因。H2O2是機(jī)體代謝產(chǎn)生的一種氧自由基，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到H2O2的刺激后，打破了原本的氧化與抗氧化平衡狀態(tài)，引起細(xì)胞功能障礙，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[3-4]。本實(shí)驗(yàn)選取50 umol/L的H2O2作用于EC-304細(xì)胞，建立氧化應(yīng)激損傷模型。預(yù)先加入HSYA可以提高細(xì)胞的存活率，提高細(xì)胞中SOD表達(dá)水平及NO的含量，且呈一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。SOD是機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系的主要成員，可以有效地清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，其含量越高表明機(jī)體的抗氧化能力越強(qiáng)。NO在體內(nèi)具有廣泛生理作用，在血管系統(tǒng)中，它主要由內(nèi)皮細(xì)胞釋放，可以阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)平滑肌以調(diào)節(jié)血管張力，減少血小板聚集，防止血栓形成。NO的生成量減少被認(rèn)為是血管內(nèi)皮功能障礙的原因之一[5]。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞由基因調(diào)控的一種自主有序的死亡，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的方式。其中與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的基因包括Bcl-2、Caspase兩大家族。Bcl-2蛋白家族是由B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）編碼而成，包括Bcl-2樣促生存亞家族和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）樣促凋亡亞家族，正常細(xì)胞中這兩者處于平衡狀態(tài)。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bax通過(guò)與Bcl-2形成異源二聚體，封閉 Bcl-2活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。因此Bax與Bcl-2比值是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵因素。Caspase是一類(lèi)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，Caspase蛋白酶家族有11個(gè)成員，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[7]，Caspase依賴(lài)的凋亡通路主要包括死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路和線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡通路[8-9]。死亡受體與配體結(jié)合激活Caspase-8，線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C激活Caspase-9，兩條通路最終都刺激Caspase級(jí)聯(lián)，激活Caspase-3?；罨奶於彼崽禺愋园腚装彼岬鞍酌福╟levead Caspase-3）與Bcl-2結(jié)合，抑制其活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，因此，Caspase-3在凋亡程序中起到執(zhí)行者的關(guān)鍵作用[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入HSYA的藥物組Bax和Bax/Bcl-2的比值顯著降低，Bcl-2的比值顯著升高，Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達(dá)含量顯著降低，提示HSYA可以抑制細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激損傷。

HSYA作為中藥紅花的主要活性成分，近年來(lái)對(duì)其抗氧化作用的研究較多[12-13]，但是對(duì)其在心血管系統(tǒng)的抗氧化研究并不多。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HSYA保護(hù)H2O2造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，HSYA可以提高損傷細(xì)胞的增殖率，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，抑制細(xì)胞凋亡，并且具有劑量依賴(lài)性。這一結(jié)果為我們深入研究HSYA保護(hù)心血管疾病的作用機(jī)制和途徑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，奠定了新思路。

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