于琦 楊雨荷 劉歡 鄭昕雨 孔繁秋 張海瑩 宋紅

摘 要：【目的】探討花楸（Sorbus pohuashanensis）花粉超低溫保存及再生的方法，以延長其花粉保存時間，為科研、生產(chǎn)提供理論和實踐依據(jù)?！痉椒ā糠謩e設(shè)置不同培養(yǎng)基配方、不同光照、不同采集時間處理，進行花楸花粉離體萌發(fā)試驗，測定各試驗處理的花粉萌發(fā)率;設(shè)置不同冷凍方式和化凍方式處理，測定兩種方式不同處理的花粉萌發(fā)率;制備不同含水率的花粉，分別測定其在超低溫保存前、后的萌發(fā)率?！窘Y(jié)果】（1）培養(yǎng)基為100 g·L-1蔗糖+100 mg·L-1硼酸的處理，花粉萌發(fā)率最高，達72.42%;（2）黑暗處理花粉萌發(fā)率為77.24%，比光照處理高8.96個百分點;（3）一天中，10∶00和14∶00采集的花粉，其活力顯著高于其他時間采集的花粉;（4）-20℃預冷凍培養(yǎng)30 min后投入液氮保存24 h的處理效果最好，花粉萌發(fā)率達43.15%;（5）超低溫保存后40℃水浴解凍5 min處理比其他解凍方式處理的花粉活力高，萌發(fā)率為35.70%;（6）花楸花粉超低溫保存最適含水率為7.72%，此含水率下花粉超低溫保存后萌發(fā)率最高，為31.53%。【結(jié)論】花楸花粉采用超低溫技術(shù)保存24 h后仍具有活力，黑暗條件、花粉采集時間、花粉萌發(fā)培養(yǎng)基、花粉含水率、冷凍與化凍方式均會對花楸花粉超低溫保存效果產(chǎn)生顯著影響。

關(guān)鍵詞：花楸;花粉;超低溫保存;種質(zhì)資源保護

中圖分類號：S 686文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）04-409-07

Abstract： 【Objective】Cryopreservation and regeneration of pollens of Sorbus pohuashanensis were investigatied. 【Method】 An in vitro method was developed with experiments on medium formulation， light exposure， and pollen collection for the pollen germination rate determination.The germination rates of? S.pohuashanensis pollens treated by various freezing and thawing procedures? and different moisture contents before and after the treatments were compared. 【Result】（1） The medium for optimum pollen germination was found to consist of? sucrose 100 g·L-1 and? boric acid 100 mg·L-1 that delivered a rate of 72.42%. （2） Incubation in darkness yielded a germination rate of 77.24%， which was 8.96 percentage point higher than that under light exposure. （3） The vitality of pollens collected at 10 a.m. or 2 p.m. was significantly higher than other time in a day. （4） Among all cryopreservation methods tested， pre-freezing pollens at -20℃ for 30 min prior to submerging in liquid nitrogen for 24 h provided the greatest germination rate of 43.15% after thawing. （5） For thawing， soaking the frozen pollens in a 40℃ water bath for 5 min rendered the highest germination rate of 35.70%. （6） Moisture content of the pollens for the cryopreservation was determined to be 7.72% to result in the best germination rate of 31.53% after thawing. 【Conclusion】The cryopreservation conditions for S. pohuashanensis pollens as established would result in high viability and germination rate after storage.

Key words： Sorbus pohuashanensis; pollen; cryopreservation; germplasm preservation

0 引言

【研究意義】植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)是指在液氮（-196℃）的超低溫條件下將植物的器官進行保存，如此低溫條件下，植物材料中與細胞生長代謝有關(guān)的各種生物酶的活性受到極大抑制，生物體新陳代謝活動基本停止，處于“生機停頓”狀態(tài)，從而可以延長植物材料保存時間，理論上實現(xiàn)植物種質(zhì)資源的永久保存[1]。對于具有良好觀賞價值、食用價值和藥用價值的花楸來說，研究探討其花粉的超低溫保存及再生的最佳方式方法具有重要意義?；ǚ凼怯N的重要材料和植物種質(zhì)的重要形式，采用超低溫保存方法可以延長花粉保持生活力的時間，從而克服花期不遇、地理分隔等困難，為雜交育種，單倍體育種奠定基礎(chǔ)，促進新品種培育;同時，實現(xiàn)花粉超低溫保存可為其種質(zhì)資源的保存和交換提供更經(jīng)濟便捷的方式?！厩叭搜芯窟M展】國外較早開展花粉超低溫保存的研究，1922年Knowlton最早報道了金魚草花粉經(jīng)-180℃貯存后仍有活力[2]。20世紀80年代，花粉超低溫保存在我國日漸興起。目前，花粉超低溫保存技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和園林植物等，如牡丹、丁香、山茶和桃葉衛(wèi)矛[3-6]等園林植物均已成功進行了花粉的超低溫保存?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于超低溫保存花粉的效果因植物材料的不同有很大的差異，而有關(guān)花楸花粉超低溫保存方面的研究未見報道，本研究從影響花粉超低溫保存效果的主要因素入手，以花粉萌發(fā)培養(yǎng)基、花粉日活力最高時間，以及進行超低溫保存的花粉最佳含水率、預冷凍方式與化凍方式為切入點，進行上述各主要影響因素的單因素試驗。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確花楸花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，光照對花粉萌發(fā)的影響，花粉日活力最高的時間，以及進行花粉超低溫保存的最佳預冷凍方式、化凍方式與花粉最佳含水率，提出花楸花粉超低溫保存的最佳方式方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花楸花粉采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學校園內(nèi)，于2018年5月花楸花期內(nèi)選擇晴朗的天氣，直接采集花朵，置于硫酸紙袋內(nèi)帶回實驗室，在實驗室內(nèi)抖落花藥上的花粉，完成對花粉的收集。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉生活力測定方法

花粉培養(yǎng)采用懸滴萌發(fā)法[7]。將花粉放入25℃人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后取出，于電子顯微鏡下觀察，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率?；ǚ酃荛L度超過花粉直徑2倍記為花粉萌發(fā)。視野內(nèi)花粉萌發(fā)率=視野內(nèi)花粉萌發(fā)數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù)。每次隨機選取5個視野，視野內(nèi)花粉萌發(fā)率的平均值為該次測定花粉的萌發(fā)率。

1.2.2 花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基篩選試驗

進行不同質(zhì)量濃度的蔗糖與硼酸二因素交叉試驗。試驗設(shè)蔗糖質(zhì)量濃度梯度為50、100、150、200 g·L-1，硼酸質(zhì)量濃度梯度為100、150、200 mg·L-1，組合為12個培養(yǎng)基配方處理，3次重復，即每個處理觀測3個載玻片，每個載玻片隨機選取5個視野統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

1.2.3 光照對花粉萌發(fā)力的影響試驗

設(shè)置黑暗和光照兩個處理。以在盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿外面包裹錫紙為黑暗處理，不包錫紙為光照處理。均放入25℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。每組重復3個試驗，觀察及統(tǒng)計花粉萌發(fā)率同1.2.2。

1.2.4 花粉日活力的測定

選擇晴朗天氣，一天內(nèi)分別于8∶00、10∶00、12∶00、14∶00、16∶00采集花粉，測定不同采集時間的花粉萌發(fā)率。

1.2.5 花粉預冷凍處理試驗

將新鮮花粉裝入1.8 mL冷凍管中，設(shè)置5個處理，即：不經(jīng)預冷凍（CK）;-4℃恒溫預冷凍30 min;-20℃恒溫預冷凍30 min;-80℃恒溫預冷凍30 min;逐級變溫預冷凍（-4℃、30 min→-20℃、30 min→-80℃、30 min），然后均立即投入液氮里儲存24 h。

此時間設(shè)置的依據(jù)是：花粉超低溫保存24 h后，時間長短對花粉活力無顯著影響[4，8-9]?；瘍龊蠓謩e測定其花粉萌發(fā)率。

1.2.6 花粉化凍方式試驗

新鮮花粉從上述液氮中保存24 h后取出，分別用自來水化凍5 min，40℃水浴化凍2 min，25℃室溫下化凍30 min，測定3種化凍方式的花粉萌發(fā)率。

1.2.7 不同含水率花粉的超低溫保存試驗

采用烘干法測定花粉初始含水量M0[10]。

采用硅膠干燥法制備不同含水率的花粉。稱量新鮮花粉的質(zhì)量（Ma），裝入1.8 mL干燥管后稱量總質(zhì)量（Mb），將盛有新鮮花粉的干燥管放入硅膠干燥器中干燥一段時間后稱量質(zhì)量記為Mc。

利用上述方法將新鮮花粉分別干燥2.5、5.0、7.5 h，得到含水率分別為9.94%、7.72%、4.84%的花粉。分別測定不同含水率花粉投入液氮冷凍前的萌發(fā)率和投入液氮保存24 h后的萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對花粉萌發(fā)力的影響

由圖1可知，花粉萌發(fā)率在不同培養(yǎng)基處理間差異達顯著水平（P<0.05）。當硼酸質(zhì)量濃度固定在100 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，呈現(xiàn)先顯著增加后顯著減小的趨勢，最高值出現(xiàn)在蔗糖質(zhì)量濃度為100 g·L-1時，其萌發(fā)率達72.42%;當硼酸質(zhì)量濃度固定在150 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率隨蔗糖質(zhì)量濃度的增加，也是呈現(xiàn)先顯著增加后顯著減小的趨勢，最高值出現(xiàn)在蔗糖質(zhì)量濃度150 g·L-1時，其萌發(fā)率達53.65%;當硼酸質(zhì)量濃度固定在200 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率隨蔗糖質(zhì)量濃度增加而顯著下降，最高值出現(xiàn)在蔗糖質(zhì)量濃度50 g·L-1時，其萌發(fā)率為36.96%。當蔗糖質(zhì)量濃度固定在50 g·L-1時，硼酸質(zhì)量濃度的改變對花粉萌發(fā)率沒有顯著影響，其萌發(fā)率在36.95%～42.63%;其他3個蔗糖質(zhì)量濃度處理（100、150、200 g·L-1），均表現(xiàn)為隨著硼酸質(zhì)量濃度的改變，花粉萌發(fā)率都顯著改變，但變化趨勢并不相同?？梢?，在雙因素試驗中，其中一個因素質(zhì)量濃度的改變，其花粉萌發(fā)率并未表現(xiàn)出相同的變化趨勢，說明一個因子對花粉萌發(fā)是發(fā)揮促進作用或抑制作用是由另一個因子決定的，培養(yǎng)基中的蔗糖和硼酸存在最佳質(zhì)量濃度配比的問題，本試驗中花粉萌發(fā)率最高的處理組合是蔗糖100 g·L-1、硼酸100 mg·L-1處理，其花粉萌發(fā)率可達72.42%。

對花楸花粉在不同蔗糖和硼酸質(zhì)量濃度培養(yǎng)基上的萌發(fā)率進行方差分析發(fā)現(xiàn)，花粉的萌發(fā)率在蔗糖質(zhì)量濃度間、硼酸質(zhì)量濃度間、硼酸質(zhì)量濃度×蔗糖質(zhì)量濃度間均具有顯著性差異。在硼酸質(zhì)量濃度相同時，蔗糖質(zhì)量濃度200 g·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低;在蔗糖質(zhì)量濃度相同時，硼酸質(zhì)量濃度200 mg·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低。可見，硼酸或蔗糖的質(zhì)量濃度過高都會抑制花楸花粉的萌發(fā)。

2.2 光照對花粉萌發(fā)力的影響

由圖2可知，采集的花粉置于100 g·L-1蔗糖+100 mg·L-1硼酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在光照和黑暗兩種不同培養(yǎng)條件下花粉萌發(fā)率差異達顯著水平。光照處理的花粉萌發(fā)率為68.28%，黑暗處理的花粉萌發(fā)率為77.24%。說明黑暗條件更有利于花楸花粉的萌發(fā)。

2.3 花粉日活力變化

由圖3可知，同一天內(nèi)不同時間花楸花粉的萌發(fā)率不同。在10∶00和14∶00花粉萌發(fā)率達到一天中的兩個高峰，分別為66.70%和65.81%，12∶00花粉萌發(fā)率大幅下降，在14∶00達到一天中最高后急劇下降，在16∶00達到一天中最低的萌發(fā)率。經(jīng)過方差分析，10∶00與14∶00花粉萌發(fā)率差異不顯著，但二者與一天中其他時間花粉萌發(fā)率的差異均達顯著水平（P<0.05）。觀測結(jié)果表明，花楸花粉在一天中活力最強的時間為10∶00和14∶00，此時采集的花粉萌發(fā)率最高。

2.4 預冷凍方式對花粉超低溫保存效果的影響

由圖4可知，不同預冷凍處理對花楸花粉超低溫保存效果的影響有顯著差異。以-20℃預冷凍30 min的花粉萌發(fā)率最高，達43.15%，與其他預冷凍方式比較差異顯著（P<0.05）。經(jīng)-80℃預冷凍30 min和不經(jīng)預冷凍直接投入液氮的花粉萌發(fā)率差異不顯著;-4℃預冷凍30 min處理的花粉萌發(fā)率最低，為15.04%，顯著低于其他處理。試驗結(jié)果表明，花楸花粉經(jīng)-20℃預冷凍30 min的超低溫保存效果最好。

2.5 化凍方式對花粉萌發(fā)率的影響

由圖5可知，不同化凍方式處理間的花粉萌發(fā)率差異均達顯著水平（P<0.05）。以40℃水浴化凍2 min處理的萌發(fā)率最高，為35.70%，均顯著高于自來水化凍5 min和25℃室溫化凍30 min兩個處理。試驗結(jié)果表明，花粉超低溫保存后40℃水浴化凍2 min效果最好，可作為下一步試驗的依據(jù)。

2.6 不同含水率花粉超低溫保存前后的萌發(fā)率

由圖6可知，不同含水率的花楸花粉超低溫保存前后萌發(fā)率有所差異。冷凍前，含水率為12.63%、9.94%、7.72%的花粉萌發(fā)率差異不顯著，均高于25%，說明含水率在7.72%～12.63%時，含水率對冷凍前花粉的萌發(fā)率影響不大;但當含水率降到4.86%時，無一花粉萌發(fā)。冷凍后，含水率較低的兩個處理（4.84%、7.72%）差異不顯著;當含水率超過7.72%后，花粉萌發(fā)率會出現(xiàn)顯著下降趨勢。本試驗結(jié)果表明，花楸花粉含水率為7.72%為最適宜花粉萌發(fā)的含水率。

含水率為9.94%和12.63%的花粉在冷凍后萌發(fā)率均有所下降，且凍前凍后花粉萌發(fā)率差異顯著;而含水率為4.84%和7.72%的花粉在冷凍后萌發(fā)率均有所升高，其中含水率4.84%的花粉凍前凍后萌發(fā)率差異顯著，含水率7.72%的花粉凍前凍后萌發(fā)率差異不顯著。說明適宜的含水率不會造成花粉冷凍后萌發(fā)率的顯著改變。

3 討 論

蔗糖和硼酸對花粉管的萌發(fā)和伸長具有重要作用。蔗糖作為花粉萌發(fā)的能源物質(zhì)，不僅起到提供能量的作用，還具有維持細胞滲透壓的作用[11]。硼酸可以與糖類物質(zhì)結(jié)合，促進花粉管對糖類物質(zhì)的利用[12]。適宜的蔗糖和硼酸配比對花粉萌發(fā)有顯著影響。本試驗中不同蔗糖和硼酸配比處理的花粉萌發(fā)率差異顯著，在蔗糖100 g·L-1+硼酸100 mg·L-1培養(yǎng)基培養(yǎng)下的花粉萌發(fā)率最高，顯著高于其他處理。Brewbaker等[13]認為，硼酸是花粉萌發(fā)和花粉管伸長的重要影響因子，對大多數(shù)物種來說最佳質(zhì)量濃度為100 mg·L-1，本試驗結(jié)果與之一致。在蔗糖質(zhì)量濃度為50～150 g·L-1時，均以硼酸質(zhì)量濃度200 mg·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低;在硼酸質(zhì)量濃度50～200 mg·L-1時，均以蔗糖質(zhì)量濃度200 g·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低。究其原因，可能與培養(yǎng)基中蔗糖或硼酸質(zhì)量濃度過高，使花粉細胞失水，抑制了花粉的萌發(fā)有關(guān)。前人的研究表明，花粉萌發(fā)與蔗糖、硼酸、鈣、生物調(diào)節(jié)物質(zhì)及pH值等因素有關(guān)，在復雜配方的培養(yǎng)基中蔗糖、硼酸的配比還有待于進一步的探究。

不同光照條件對不同植物花粉萌發(fā)率的影響不同。馬尾松在黑暗條件下的花粉萌發(fā)率高于光照條件，但未達到顯著差異水平[14];蒿柳在黑暗條件下的花粉萌發(fā)率顯著低于光照條件 [15];光照和黑暗對柳樹和桂花花粉萌發(fā)無顯著影響[16-17]。而本試驗與以上結(jié)果均不同。本試驗結(jié)果顯示，在黑暗條件下花楸花粉萌發(fā)率高于光照條件，且差異達顯著水平（P<0.05）?；ǚ鄣碾x體萌發(fā)是模擬花粉在花中的萌發(fā)環(huán)境，本試驗結(jié)果可能與花粉萌發(fā)時花楸花的狀態(tài)有關(guān)，具體原因有待進一步探究。

花粉在一天中不同時間的活力不同，而不同植物花粉日活力變化趨勢也不同。桂花花粉萌發(fā)率從8∶00到16∶00逐漸升高[18];甘蔗花粉一天中隨著時間推移花粉萌發(fā)率逐漸降低，13∶00時花粉完全喪失活力[19];亞洲百合和萬壽菊一天中花粉活力的變化為先升高后降低[20-21]。本試驗中花楸花粉日活力的變化與上述植物的表現(xiàn)均不相同，花楸花粉活力在上午和下午分別呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，分別在10∶00和14∶00達到兩個峰值。一天中隨著時間的變化，溫度和光照強度也隨之變化。一定的溫度和光照強度可以促進花粉的發(fā)育和成熟，10∶00和14∶00的光照強度和溫度可能最適宜花楸花粉的萌發(fā)，其花粉萌發(fā)率高;而12∶00的光照強度和溫度均過高，其花粉萌發(fā)率較其他時間段低。

花粉超低溫保存過程中預冷凍可以使細胞內(nèi)的自由水發(fā)生保護性脫水，進行體外結(jié)冰，減少細胞內(nèi)的冰晶，從而減少細胞受到冰晶機械損傷，同時預冷凍可以使細胞進行抗寒鍛煉，提高耐寒性。預冷凍因植物材質(zhì)的不同所產(chǎn)生的效果也不同。在對百合花粉的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過-20℃預冷凍的花粉萌發(fā)率顯著高于室溫、0℃、-70℃的處理 [22];對甘藍型油菜的研究顯示，逐步降溫預冷凍處理對花粉形態(tài)和大小影響最小[9];馬鈴薯經(jīng)過逐級降溫預冷凍處理，花粉活力在超低溫保存后有所提高[23]。本試驗中，對新鮮花粉分別設(shè)置5種預冷凍處理，-80℃預冷凍處理和不經(jīng)預冷凍處理的花粉超低溫保存后花粉萌發(fā)率相差甚微，說明對于花楸花粉，-80℃下的預冷凍沒有效果。逐級變溫預冷凍處理的花粉超低溫保存后花粉萌發(fā)率均顯著高于-4℃預冷凍處理、-80℃預冷凍處理和不經(jīng)預冷凍處理，但其花粉萌發(fā)率低于-20℃預冷凍處理的花粉，這表明花楸花粉在-20℃冷凍30 min的預冷凍方式最佳。這可能是由于花楸花粉在-20℃時，細胞膜的透性處于最適狀態(tài)，有利于細胞發(fā)生保護性脫水，因而受到冰晶機械損傷程度最小，而-4℃和-80℃預冷凍處理因溫度過低或過高，均不利于細胞發(fā)生保護性脫水。預冷凍對花粉超低溫保存后的效果與含水率有較大關(guān)系，花楸花粉含水率與預冷凍的效果的關(guān)系有待于進一步探究。

解凍過程中有發(fā)生次生結(jié)冰，對細胞產(chǎn)生機械損傷，以及細胞吸水對細胞產(chǎn)生沖擊的風險。因此，選擇適宜的解凍方式對花粉超低溫保存后恢復活力十分重要。目前采用較多的解凍方式有自來水化凍、室溫解凍、水浴解凍。本試驗設(shè)置40℃水浴化凍2 min、自來水化凍5 min和25℃室溫化凍30 min等3個處理，結(jié)果顯示40℃水浴化凍（2 min）效果最好，這與前人對百合[22]和山茶[5]的研究結(jié)果相一致。

大量研究結(jié)果顯示，花粉含水率是花粉超低溫保存成敗的關(guān)鍵。含水率會影響花粉預冷凍和解凍方式的選擇，當含水率過高時，花粉更容易產(chǎn)生冰晶，對細胞產(chǎn)生機械損傷;當含水率過低時，花粉無法滿足其基本生理需求。本試驗中花楸花粉含水率在4.84%時，花粉冷凍前的萌發(fā)率為零，這與花粉生理性缺水會影響其生理活性有關(guān)，但經(jīng)過超低溫保存后，其花粉萌發(fā)率顯著升高，這種現(xiàn)象在山茶某些品種中也有出現(xiàn)[4]，其原因目前尚不清楚?；ǚ酆蕿?.94%和12.63%（為初始含水率）時花粉超低溫保存前后，花粉萌發(fā)率均有所下降，這可能與花粉相對含水率較高產(chǎn)生冰晶有關(guān)。花粉超低溫保存后，含水率為7.72%的花粉萌發(fā)率最高，且冷凍前后的萌發(fā)率無顯著差異。因此，建議花楸花粉經(jīng)干燥5 h（含水率為7.72%）后進行超低溫保存，但是在實際生產(chǎn)中，考慮到經(jīng)濟快捷的原則，也可不進行干燥，對初始含水率的花楸花粉直接進行超低溫保存。

本試驗分別探究了花粉超低溫保存不同技術(shù)環(huán)節(jié)下的最佳處理，對于不同處理組合間綜合作用關(guān)系及完整的花楸花粉超低溫保存體系的建立還有待于進一步探究。

參考文獻：

[1]陳曉玲， 張金梅， 辛霞，等. 植物種質(zhì)資源超低溫保存現(xiàn)狀及其研究進展[J]. 植物遺傳資源學報， 2013，14（3）：414-427.CHEN X L， ZHANG J M， XIN X，et al. Progress on cryopreservation state and research of plant germplasm resources[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2013，14（3）：414-427.（in Chinese）

[2]KNOWLTON H E. Studies in pollen with special reference to longevity[J]. Cornell Univ Agr Exp Sta Mem，1922，52：751-793.

[3]李秉玲， 王荷， 劉燕. 日本牡丹品種花粉超低溫保存[J]. 北京林業(yè)大學學報， 2010，32（4）：297-300.LI B L， WANG H， LIU Y. Pollen cryopreservation of Japanese tree peony cultivars[J]. Journal of Beijing Forestry University， 2010，32（4）：297-300.（in Chinese）

[4]劉芊， 徐瑾， 石印，等. 丁香屬12種植物花粉保存方法研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報， 2014，26（3）：615-620.LIU Q， XU J， SHI Y，et al. Storage methods of 12 species of lilac （ Syringa L.） pollen[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis， 2014，26（3）：615-620.（in Chinese）

[5]常維霞， 姚小華， 龍偉. 山茶屬3種植物花藥超低溫保存研究[J]. 中國油料作物學報， 2016，38（1）：52-57.CHANG W X， YAO X H， LONG W. Anther cryopreservation of 3 Camellia species[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2016，38（1）：52-57.（in Chinese）

[6]李萬義， 孔鑫， 韓亞潔，等. 桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2018，46（10）：144-148.?LI W Y， KONG X， HAN Y J，et al. Pollen cryopreservation of Euonymus maackii Rupr.[J]. Jiangsu Agricuitural Sciences， 2018，46（10）：144-148.（in Chinese）

[7]胡適宜. 植物胚胎學實驗方法（一）花粉生活力的測定[J]. 植物學通報， 1993，10（2）： 60-62.?HU S Y. Experimental methods in plant embryology（I）Determination of pollen viability[J]. Chinese Bulletin of Botany， 1993，10（2）： 60-62.（in Chinese）

[8]劉婷婷， 代其林， 奉斌，等. 甘藍型油菜花粉超低溫保存及其花粉活力的研究[J]. 生物技術(shù)通報， 2010（3）：114-118.LIU T T， DAI Q L， FENG B，et al. Studies on the activity of pollens in Brassica napus L. cryopreserved under ultralow temperature[J]. Biotechnology Bulletin， 2010（3）：114-118.（in Chinese）

[9]姜忠國，董丹，張琪，等. 玉蟬花花粉生活力檢測和超低溫保存研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2016，44（1）：216-219，222.?JIANG Z G， DONG D， ZHANG Q，et al. The viability detection and pollen cryopreservation of Iris ensata Thunb[J]. Journal of Anhui Agri， 2016，44（1）：216-219，222.（in Chinese）

[10]王小敏， 李海燕， 吳文龍，等. 蓬蘽花粉低溫貯藏研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2010（3）：170-171.?WANG X M， LI H Y， WU W L，et al. Study on storage of Rubus hirsutus Thunb. pollen at low temperature[J]. Jiangsu Agricuitural Sciences， 2010（3）：170-171.（in Chinese）

[11]潘瑞熾.植物生理學[M]. 北京：高等教育出版社， 2001： 260.PAN R Z. Plant Physiology[M]. Beijing：Higher Education Press， 2001： 260.（in Chinese）

[12]楊曉冬，孫素琴，李一勤. 硼缺乏導致花粉管細胞壁多糖分布的改變[J]. 植物學報， 1999（11）：1169-1176.YANG X D， Sun S Q， Li Y Q. Boron deficiency causes Changes in the distribution of Major polysaccharides of pollen tube wall[J]. Acta Botanica Sinica， 1999（11）：1169-1176.（in Chinese）

[13]BREWBAKER J， MAJUMDER S K. Cultural studies of the pollen population effect and the self-incompatibility inhibition[J]. American Journal of Botany，1961，48（6）： 457-464.

[14]徐進， 陳天華， 王章榮，等. 不同貯藏方法及光照對馬尾松花粉活力的影響[J]. 南京林業(yè)大學學報， 1998（3）：74-77.?XU J， CHEN T H， WANG Z R，et al. Effects of different storage methods and light on pollen viability of Pinus massoniana[J] Journal of Nanjing Forestry University， 1998（3）：74-77.（in Chinese）

[15]彭向永， 劉俊祥， 李振堅，等. 蒿柳花粉離體萌發(fā)及花粉管生長特性[J]. 北京林業(yè)大學學報， 2017，39（3）：81-86.?PENG X Y， LIU J X， LI Z J，et al. Characteristics of pollen germination and pollen tube growth in Salix viminalis in vitro[J]. Journal Of Beijing Forestry University， 2017，39（3）：81-86.（in Chinese）

[16]王偉偉， 姚玲， 何開躍， 等. 不同柳樹花粉離體培養(yǎng)及活力測定方法比較研究[J]. 江蘇林業(yè)科技， 2018，45（4）：1-7.?WANG W W， YAO L， HE K Y，et al. Comparative study on in vitro pollen germination and viability evaluation of different willow species[J]. Journal of Jiangsu Forestry Science & Technology， 2018，45（4）：1-7.（in Chinese）

[17]張洪偉， 段一凡， 李稚，等. 不同貯藏方法對桂花花粉活力影響的研究[J]. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版）， 2014，38（S1）：7-12.?ZHANG H W， DUAN Y F， LI Z，et al. Study on effects of different storage methods on pollen vitality of Osmanthus fragrans[J]. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition）， 2014，38（S1）：7-12.（in Chinese）

[18]李稚. 桂花傳粉生物學與雜交育種研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學， 2014.?LI Z. Pollination biology and cross breeding of Osmanthus fragrans Lour[D]. Nanjing：Nanjing Forestry University， 2014.（in Chinese）

[19]常海龍， 張垂明， 張偉，等. 甘蔗花粉活力和柱頭可授性日變化研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學， 2017，44（4）：14-18.?CHANG H L， ZHANG C M， ZHANG W，et al. Study on diumal variation of sugarcane′s pollen vitality and stigma energy[J]. Guangdon Agricultura Sciences， 2017，44（4）：14-18.（in Chinese）

[20]崔光芬， 杜文文， 段青，等. 不同倍性亞洲百合的花粉形態(tài)與活力變化規(guī)律分析[J]. 華北農(nóng)學報， 2015，30（S1）：55-60.?CUI G F， DU W W， DUAN Q，et al. Analysis on pollen morphology and variation of viability of lilium asiatic hybrids with different ploidy[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2015，30（S1）：55-60.（in Chinese）

[21]趙劍穎， 張華麗， 張西西，等. 萬壽菊花粉活力及柱頭可授性研究[J]. 中國農(nóng)學通報， 2012，28（19）：159-163.ZHAO J Y， ZHANG L H， ZHANG X X，et al. Pollen viability and stigma receptivity of Tageteserecta[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2012，28（19）：159-163.（in Chinese）

[22]時婷婷， 張桂玲， 溫四民，等. 百合花粉超低溫保存方法研究[J]. 北方園藝，2013（3）：64-66.?SHI T T， ZHANG G L， WEN S M，et al. Pollen cryopreservation of Lilium[J]. Northern Horticulture， 2013（3）：64-66.（in Chinese）

[23]王玉萍， 張峰， 王蒂. 馬鈴薯花粉的超低溫保存研究[J]. 園藝學報， 2003（6）：683-686.?WANG Y P， ZHANG F， WANG D. Study on pollen cryopreservation of Solanum tuberosum L.[J]. Acta HorticulturaeSinica， 2003（6）：683-686.（in Chinese）

（責任編輯：楊小萍）