袁濱 柯麗娜 黃藝寧 張志鴻 連燕萍 張丹鳳

摘 要：【目的】準確、科學地鑒定灰樹花菌株，明確其親緣關系?！痉椒ā坎捎棉卓购虸SSR分子標記對供試的11個灰樹花菌株進行鑒定和遺傳多樣性分析。【結(jié)果】拮抗反應表明，供試菌株之間拮抗作用有一定差異，根據(jù)拮抗反應的有無，供試菌株分為4組。ISSR分子標記分析表明，當相似性系數(shù)達到0.87水平時，供試菌株聚成5組，第1組包括菌株1（石家莊灰樹花）、2（臺灰）、10（XG-W）、5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圓）;第2組為菌株11（CN-9）;第3組為菌株4（Gr0003）;第4組包括菌株8（H）、9（Hokto）;第5組為菌株3（Gr20）。【結(jié)論】拮抗反應與ISSR兩種方法結(jié)論較一致，推測石家莊灰樹花與臺灰，Gr0001+2、CN與雪圓，H與Hokto這3組菌株分別來源于同一個菌株，屬于同種異名現(xiàn)象Gr0003、H和Hokto親緣關系較遠;Gr20與其他菌株親緣關系最遠。

關鍵詞：拮抗;ISSR技術;灰樹花;鑒定;聚類分析

中圖分類號：S 646文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）04-393-07

Abstract： 【Objective】To reliably identify strains of Grifola frondosa and precisely determine the genetic relationship among them. 【Method】The identification and genetic diversity analysis on 11 strains of G. frondosa were carried out by the combined use of the antagonistic challenging test and ISSR. 【Result】The antagonistic test on the strains demonstrated apparent differences on their responses. Presence or absence of antagonism allowed the classification of the strains into 4 distinct groups. Meanwhile， from the ISSR analysis， when the similarity coefficient reached 0.87， the strains were clustered into 5 groups. They were Group 1 that included Strain #1 （Shijiazhuang ash tree flower）， Strain #2 （stage ash）， Strain #10 （XG-W）， Strain #5 （Gr0001+2）， Strain #6 （CN）， and Strain #7 （snow circle）; Group 2， Strain #11 （CN-9）; Group 3， Strain #4 （Gr0003）; Group 4， Strain #8 （H） and Strain #9 （Hokto）; and， Group 5， Strain #3 （Gr20）. 【Conclusion】It appeared that Strain #1 and Strain #2 belonged to a same species; so were Strains #5， Strain #6 and Strain #7， and Strains #8 and Strain #9. At the similarity coefficient of 0.8， Strain #4 could be clustered with Strain #8 and Strain #9 with slight differences indicating a distance on genetic relationship among them. Strain #3 had a lowest coefficient of 0.34， therefore， it was most remotely related to all.

Key words： antagonistic effect; ISSR; Grifola frondosa; identification; cluster analysis

0 引言

【研究意義】灰樹花Grifola frondosa又名栗蘑、貝葉多孔菌、千佛菌等，屬于擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌屬[1-3]，是一種珍貴的藥、食兩用真菌。灰樹花子實體肉質(zhì)鮮美，口感脆嫩可口，富含多種維生素、蛋白質(zhì)和氨基酸，且藥用價值較高，含有多種活性成分[4]，具有抗腫瘤、抗病毒、增強免疫力、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降低血脂等醫(yī)療保健作用[1，5-10]，是非常有市場前景的珍稀食用菌[11]。近年來灰樹花在我國栽培面積不斷擴大，但由于起步較晚，生產(chǎn)中使用的品種主要來自野生馴化或引進日本品種，存在適應能力差、生物轉(zhuǎn)化率低、品種比較單一等缺點[12]。為了適應不斷擴大、多樣化的市場需求，亟需新的優(yōu)良的灰樹花品種。雜交育種作為食用菌常規(guī)育種的主要方法[13]，親本選擇是雜交育種最關鍵的因素。但現(xiàn)在市場上灰樹花品種較為混亂，有些食用菌制種戶，相互引種后，又冠上新名，導致灰樹花同種異名，同名異種現(xiàn)象普遍存在，這一方面嚴重損害栽培戶的生產(chǎn)積極性，另一方面也不利于科研工作者開展雜交育種工作。因此，收集鑒定主栽的灰樹花菌株，分析其親緣關系，為今后的雜交育種提供依據(jù)具有重要的現(xiàn)實意義。 【前人研究進展】拮抗反應是真菌體細胞不親和性的具體體現(xiàn)[14]，可用于鑒定食用菌品種遺傳差異，利用菌株之間的拮抗反應判斷兩者的親緣關系。具有操作簡單，快速的優(yōu)點[15]，但對于遺傳背景較相近的菌株難以鑒別[16]。如體細胞親和的菌株可能為同一菌株，也可能存在遺傳差異，表現(xiàn)為拮抗線弱或無。即兩個菌株沒有拮抗反應，則不能確定是相同菌株。因此拮抗只能作為食用菌菌株鑒定的初步方法。而分子生物學方法能直接從 DNA水平上反映其遺傳關系，更客觀和準確[17]。ISSR是以PCR技術為核心，基于簡單重復序列擴增多態(tài)SSR建立的一種分子標記技術[18]，廣泛用于食用菌菌株鑒定、遺傳多樣性分析及雜交育種等方面[19]，ISSR技術結(jié)合了RAPD和SSR方法的優(yōu)點，具有穩(wěn)定性強、重復性高的特點[20]。王春暉等[21]等利用ISSR和RAPD標記對8個灰樹花栽培菌株進行遺傳多樣性分析，16個ISSR引物將8個菌株分為4個大類。溫志強等[22]利用RAPD、ISSR、SRAP等3種DNA分子標記分別對不同來源的30個灰樹花菌株進行鑒別，在D=0.77的相異系數(shù)水平上，可以將30個灰樹花菌株分為10個類群，其中包括6個單一類別和4個復合類群。【本研究切入點】ISSR分子標記在灰樹花菌株鑒定上有一定的應用，但目前鮮見采用拮抗和ISSR-PCR相結(jié)合對灰樹花菌株進行鑒定和遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用拮抗和ISSR-PCR相結(jié)合對收集的11個灰樹花菌株進行鑒定和遺傳多樣性分析，以期更準確、更科學鑒定收集的灰樹花菌株，確定其親緣關系，為雜交親本選配及今后的新品種的育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的灰樹花菌株11個，具體信息來源見表1。

1.2 試驗試劑

DNA提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司;Taq酶、dNTPs、10×Buffer緩沖液、Mg2+等均購自TaKaRa公司（大連）;ISSR引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成;其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 L，121℃滅菌20 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 拮抗試驗

在超凈工作臺，將活化后的供試菌株，轉(zhuǎn)接到同一平板上，按品字形接種3個不同菌株。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察不同菌株菌絲間的拮抗反應情況。試驗設置3個重復。

1.4.2 供試菌株DNA提取DNA提取采用試劑盒。

1.4.3 ISSR-PCR擴增體系

選用20個ISSR引物對供試菌株進行擴增。引物信息具體見表2，ISSR-PCR擴增體系見表3。

1.4.4 ISSR-PCR反應程序及電泳

ISSR-PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，44-50℃退火45 s，72℃ 延伸1 min 循環(huán)數(shù)35個，最后72℃ 延伸10 min。

擴增產(chǎn)物檢測：取擴增產(chǎn)物7 μL，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 μg·mL-1 GoldviewTMDNA 染料），160 V恒壓1.5 h，紫外凝膠成像系統(tǒng)照像。

1.5 數(shù)據(jù)分析

拮抗反應是根據(jù)NY/T1845-2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定方法判斷。ISSR-PCR反應分析是針對擴增產(chǎn)物進行分析，將試驗出現(xiàn)的穩(wěn)定性條帶記為1，無條帶記為0，構建“0-1”矩陣表，利用公式[23]算出多態(tài)位點百分率P。用NTSYS-pc 2.0軟件進行聚類分析，并形成供試菌株的遺傳聚類圖。

公式為：P=k/n （100%）。

式中，P為多態(tài)位點百分率，k為多態(tài)性位點數(shù)，n為位點總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的拮抗反應

供試菌株有3種典型的拮抗反應，如圖1所示。菌株1與菌株5無拮抗反應，這兩個菌株與菌株3拮抗反應強烈，表現(xiàn)為菌絲隆起。菌株8與菌株9無拮抗反應，這兩個菌株與菌株4拮抗反應明顯，表現(xiàn)為拮抗線。菌株2與菌株10拮抗反應極其不明顯，這兩個菌株與菌株4拮抗反應明顯，表現(xiàn)為溝狀。

根據(jù)拮抗反應的有無，形成供試菌株間的拮抗反應情況（表4）。由表4 可以看出，菌株 1、2、5、6、7、10、11兩兩之間沒有拮抗線或拮抗性反應極不明顯，說明這些菌株之間親緣關系較近，分為第一組;菌株8與菌株9之間沒有拮抗線，但與其他菌株均有明顯拮抗線，分為第二組;菌株3、菌株4兩兩之間及與其他菌株之間均有明顯拮抗反應，說明菌株3、菌株4親緣關系較遠，菌株3為一組，菌株4分為另外一組。綜上所述，通過拮抗反應分析可以將11個灰樹花菌株分成 4 組。

2.2 供試菌株的ISSR多態(tài)性分析

試驗選取能夠擴增出穩(wěn)定特異條帶、多態(tài)性好、條帶清晰的20條引物，分別為P1、P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P16、P17、P18、P19、P20、P23、P25、P26、P28。圖2為引物P1和P2擴增供試菌株的指紋圖譜。20條引物對供試菌株均擴增出穩(wěn)定的條帶，多態(tài)性條帶在8～18條，擴增出的DNA大小在100～2 200 bp。20條ISSR引物對供試菌株共擴增出260條穩(wěn)定性條帶，其中多態(tài)性條帶達234條，多態(tài)性比率為90.0%。

2.3 供試菌株聚類分析

從圖3可以看出，當相似性系數(shù)達到0.87時，供試菌株聚成5組，第1組包括菌株1（石家莊灰樹花）、2（臺灰）、10（XG-W）、5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圓）;第2組為菌株11（CN-9）;第3組為菌株4（Gr0003）;第4組包括菌株8（H）、9（Hokto）;第5組為菌株3（Gr20）。

供試菌株之間的遺傳相似系數(shù)在0.34～1.00，其中相似系數(shù)為1的有菌株1、2;菌株5、6、7;菌株8、9。菌株10與菌株1、2相似性系數(shù)為0.98。表明這幾組菌株之間親緣性非常近。菌株11與菌株1、2、10、5、6、7的相似性系數(shù)為0.76，菌株11與這幾個菌株有一定的差異性，親緣關系較遠。菌株4與菌株8、9的相似性系數(shù)為0.84，菌株4與菌株8、9有一定的差異性，親緣關系較遠。菌株3與其他菌株相似系數(shù)最小，為0.34，說明菌株3與其他菌株親緣關系最遠。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的食用菌菌株鑒別主要采用形態(tài)特征觀察的方法[24]，由于在栽培過程中，子實體形態(tài)特征會受到環(huán)境條件、栽培管理技術等因素的影響，出現(xiàn)較大的差異，因此單純使用形態(tài)學指標分類比較困難。拮抗反應是體細胞不親和性的具體體現(xiàn)[25]，具有操作方便、易于觀察的特點。在本試驗中，拮抗現(xiàn)象有隆起型、拮抗線、溝狀，拮抗反應較明顯。菌株 1、2、5、6、7、10、11兩兩之間沒有拮抗線，說明這些菌株之間親緣關系較近;菌株8與菌株9之間沒有拮抗線，但與其他菌株均有明顯拮抗線;菌株3、菌株4兩兩之間及與其他菌株之間均有明顯拮抗反應，說明菌株3、菌株4親緣關系較遠。

分子標記技術通過擴增供試菌株相關基因片段，尋找差異基因，因此利用分子標記對菌株進行鑒定分類具有準確、快速的特點[26]。ISSR技術大量應用在食用菌遺傳多樣性分析、雜交育種、品種鑒定等方面。如張介馳等[27]采用ISSR鑒別27個東北地區(qū)黑木耳生產(chǎn)菌株， ISSR揭示的DNA指紋多態(tài)性高，可以有效快速準確鑒別黑木耳生產(chǎn)菌株。秦蓮花等[28]結(jié)合ITS與ISSR技術，作為香菇生產(chǎn)菌株鑒別。因此本試驗采用ISSR分子標記的方法進行供試菌株鑒定。本試驗中，當相似性系數(shù)達到0.87水平時，供試菌株聚成5組，說明供試菌株具有豐富的遺傳多樣性。

有研究結(jié)果表明采用拮抗分類鑒定結(jié)果與其他鑒別方法的結(jié)果吻合。如金針菇拮抗反應分類與RAPD分析結(jié)果吻合[29]。拮抗反應和RAPD在靈芝親緣關系的鑒定結(jié)論一致[18]。杏鮑菇[30]、姬菇[31]、姬松茸[32]、香菇[28]等也存在這樣的現(xiàn)象。本試驗采用拮抗反應和ISSR-PCR兩種方法綜合鑒定供試的11個灰樹花菌株。結(jié)果表明這兩種方法所得到的結(jié)果存在一致性。如菌株1、2、5、6、7、10這7個菌株之間沒有拮抗反應，而在ISSR聚類分析時，相似性系數(shù)為0.96時，菌株1、2、10、5、6、7聚在一類，親緣關系較近，其中菌株1和菌株2，相似性系數(shù)為1，菌株10與菌株1、2相似性系數(shù)為0.98。菌株5和菌株6、菌株7相似性系數(shù)為1。而菌株3與其他所有菌株拮抗反應非常強烈，在ISSR聚類分析時單獨聚為一類，且與其他菌株的相似性系數(shù)為0.34，遺傳距離最遠。

但拮抗反應和ISSR分子標記分析還是有一定的差異，如在拮抗反應中，菌株11與菌株1、2、5、6、7、10沒有拮抗線，說明菌株11與這幾個菌株間遺傳背景較相似，親緣關系較近。而在ISSR分子標記中，在相似性為0.76時菌株11與菌株1、2、5、6、7、10聚在一起。說明拮抗反應不能有效區(qū)分兩個在遺傳背景相似或親緣關系很近的菌株[16]，因此可以通過拮抗反應進行初步分類，再通過分子標記的方法進行深入研究。

綜合這兩種方法，推測菌株1（石家莊灰樹花）與菌株2（臺灰）為同一個菌株，屬于同種異名現(xiàn)象。推測菌株5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圓）為同一個菌株，屬于同種異名現(xiàn)象。推測菌株8（H）、9（Hokto）為同一個菌株，也屬于同種異名現(xiàn)象。菌株3（Gr20）、菌株4（Gr0003）為不同菌株。單純依靠拮抗和分子標記方法作為分類學分析是不全面的，試驗結(jié)果還需要通過觀察子實體農(nóng)藝性狀及生理生化指標進一步驗證上述幾組菌株是否為同種異名現(xiàn)象。

楊軍等[33]采用ISSR和RAPD兩種分子標記的方法對供試的40株菌株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)利用兩種分子標記比單獨使用分子標記鑒定的結(jié)果準確，菌株類別劃分更精細。王守現(xiàn)等[34]采用酯酶同工酶聚類分析，將6個灰樹花菌株分為3大類，RAPD和ISSR引物驗證，其結(jié)果與酯酶同工酶分析的一致。因此可以進一步采用其他分子標記驗證本試驗結(jié)果。

在本試驗中，菌株3與其他菌株差異非常大，有必要對其進行ITS測序，判斷是否為灰樹花菌株。

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（責任編輯：林海清）