烏蘭其其格 宋學(xué)軍 段雪琴

摘要：本文利用水提醇沉法從甘草中提取甘草粗多糖，用沉淀法對(duì)提取的甘草粗多糖進(jìn)行分離純化后，得到三種多糖，即水提一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)多糖，并對(duì)粗多糖和三種分級(jí)多糖進(jìn)行了光譜性能分析.紫外光譜結(jié)果顯示，四種多糖在260-280nm處均有吸收，表明含有蛋白質(zhì)或核酸;紅外光譜結(jié)果表明，四種多糖都具有多糖的特征吸收峰.另外，根據(jù)芬頓反的原理研究了所制備的甘草多糖清除羥自由基的能力，并研究了甘草多糖對(duì)醬油中羥基自由基清除能力的影響，結(jié)果表明，加入甘草多糖的醬油試樣對(duì)羥基的清除能力有明顯的增強(qiáng).

關(guān)鍵詞：甘草多糖;提取;分級(jí);抗氧化性

中圖分類號(hào)：S567.2;O657? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2019）06-0036-03

1 前言

甘草別名還有烏拉爾甘草，國老，甜根，甜草，屬豆科，是著名的傳統(tǒng)藥用植物[1]，主要生長在內(nèi)蒙古，新疆，寧夏等地.隨著科學(xué)的發(fā)展，在1860-1869年學(xué)者們開始對(duì)甘草進(jìn)行化學(xué)方面有關(guān)的研究[2]，研究表明，甘草中含有許多藥用成分.多糖是生物體的重要組成部分，可以從植物，微生物和動(dòng)物等生物中提取.在體內(nèi)，有許多重要的生物功能，如防御功能、結(jié)構(gòu)支持和儲(chǔ)能，同時(shí)，多糖在細(xì)胞和細(xì)胞之間，細(xì)胞與外界之間的能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)化中起重要作用.作為甘草的重要活性成分之一，許多研究表明甘草多糖具有抗腫瘤，抗炎，抗病毒[3-5]，免疫調(diào)節(jié)，抗氧化和抗菌等生理活性[6，7]，常用的提取法主要有超聲輔助提取法、溶劑浸提法等[8-12].

本研究利用水提醇沉法從甘草中提取甘草粗多糖，進(jìn)行分離純化并對(duì)提取的粗多糖和三種分級(jí)多糖進(jìn)行了光譜性能分析，根據(jù)芬頓反應(yīng)原理研究了所制備的甘草多糖清除羥自由基的能力，并研究了加入甘草多糖對(duì)醬油試樣的羥基的清除能力的影響.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和材料

紅外光譜儀（Nicilet iS5），紫外光譜儀（普析），SHD-（III）循環(huán)真空泵（河南予華），可見光度計(jì)（菁華科技）;雙氧水（30%，沈陽華東試劑），抗壞血酸（紅巖試劑，硫酸亞鐵銨（雙船化學(xué)試劑），甲醇（國藥），無水乙醇（國藥），磷酸氫二鈉（國藥），二甲亞砜（沈陽華東試劑），正丁醇（恒興化學(xué)試劑），三氯化鐵（泉瑞試劑），其他試劑（KH2PO4，乙二胺四乙酸二鈉，三氯甲烷，茚三酮等）均購于國藥集團(tuán).

2.2 試劑配制

（1）0.2mol/L的PBS溶液（pH=7.4）：準(zhǔn)確稱量35.8010gNa2HPO4·12H2O，溶于500ml蒸餾水中，標(biāo)為液①;準(zhǔn)確稱量3.1120gKH2PO4·2H2O，溶于100ml蒸餾水，標(biāo)記為液②;適量混合①號(hào)溶液和②號(hào)溶液配制所需緩沖溶液.

（2）2.0mmol/L的EDTA-Fe（II）溶液：EDTANa2溶液（4.0mmol/L）：EDTANa2 0.3721g溶于250ml超純水，記為溶液①，精確稱量硫酸亞鐵銨0.3923g溶于250ml蒸餾水記為溶液②，將①、②兩種溶液按1：1的體積比進(jìn)行混合，得到2.0mmol/L的EDTANa2-Fe（II）溶液.

（3）0.52mg/mL的番紅花紅T溶液、6%的H2O2溶液、0.2%的水合茚三酮溶液的配制

準(zhǔn)確稱量藏紅花紅T0.0525g溶于超純水中，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，定容，備用.量取10ml30%的H2O2，并轉(zhuǎn)移至50ml的容量瓶中后定容.在100ml容量瓶中準(zhǔn)確稱取0.2010g茚三酮，將其溶解在乙醇中，稀釋至刻度并備用.

（4）配制5%的FeCl3溶液：在10ml容量瓶中準(zhǔn)確稱取0.5000gFeCl3，將其溶解在超純水中，并稀釋至刻度.

2.3 多糖的提取與分級(jí)

用粉碎機(jī)將天然甘草破碎過，分別脫脂、脫色，按一定比例加入溶劑攪拌均勻，靜置后置于80℃的水浴鍋中恒溫6h，冷卻至室溫后離心分離，然后將殘余物保持在燒杯中，重復(fù)上述步驟三次.將濾出四次的濾液合并，置于燒杯中，在60℃的水浴中濃縮至沒有水層后冷卻至室溫.按體一定體積比加入乙醇密封靜置36小時(shí)后過濾.將沉淀物用少量甲醇洗滌三次，并將沉淀物置于干燥的容器中真空干燥后的產(chǎn)品即為甘草粗多糖.稱取一定量的粗糖，加入蒸餾水，加熱至60℃使多糖充分溶解后冷卻至室溫后過濾，然后加入無水乙醇，當(dāng)醇的濃度達(dá)到20%時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的棕色沉淀，靜置、抽濾，干燥后所得物質(zhì)即為“水提1級(jí)多糖”.再將乙醇繼續(xù)加入上述保留的濾液中，在溶液中得到濃度為40%的無水乙醇，得到沉淀物“水提2級(jí)多糖”，如上所述繼續(xù)向母液中加入乙醇，使醇的濃度至60%，得到“水提3級(jí)多糖”，其他分級(jí)操作與1級(jí)糖的相同.

2.4 甘草多糖清除各樣品羥自由基

分別在六個(gè)試管中，吸取三毫升上述配制的PBS緩沖液，再加1.5ml濃度為2.0mmol/L的EDTA二鈉鐵，0.45ml的濃度為0.51mg/mL的番紅花紅T溶液，然后加入2.0毫升不同濃度的多糖，加入0.9ml的6%H2O2溶液后稀釋至10毫升.將混合溶液置于40℃的恒溫水浴中半小時(shí)，在520nm的波長處測(cè)定樣品吸光度.由測(cè)得的各空白和樣品的吸光度值計(jì)算清除率E（%），計(jì)算公式如下：

E（%）=（A樣品-A空白）/（A對(duì)照-A空白）*100%

3 結(jié)果和討論

3.1 甘草多糖的顯色特性

本研究對(duì)提取的甘草多糖進(jìn)行了三氯化鐵和茚三酮實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明每種甘草多糖和三氯化鐵（FeCl3）溶液樣品反應(yīng)溶液均變黃，表明不存在烯醇、酚羥基.在茚三酮顯色實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)部分多糖溶液變成紫色，表明含有氨，此結(jié)果與UV的結(jié)論一致.

3.2 紫外光譜研究

對(duì)所提取各多糖試樣進(jìn)行了紫外吸收測(cè)試，實(shí)驗(yàn)在200-900nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行.從紫外光譜測(cè)試結(jié)果可以看出，粗多糖，水提取物一級(jí)，二級(jí)和三級(jí)多糖均有吸收峰，表明粗多糖和每種分級(jí)的多糖含有蛋白質(zhì)或核酸.

3.3 紅外光譜

設(shè)定紅外光譜儀的試驗(yàn)條件，用溴化鉀壓片法制備粗多糖和各分級(jí)水提多糖紅外試樣，在4000-600cm-1之間依次掃描壓制樣品，獲得相應(yīng)多糖樣品的紅外光譜，紅外特征峰的數(shù)據(jù)示于表1.

以圖2粗多糖為例，從紅外光譜可以看出，在3450.4cm-1處有一個(gè)強(qiáng)而寬的吸收峰.這是多糖中的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰;在1635.4cm-1處是C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰;1257.3cm-1處的吸收峰是由糖環(huán)中醚環(huán)C-O-C的C-O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰;在1089.5cm-1處的強(qiáng)吸收峰是由糖環(huán)C-O-H的C-O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰;915.3在cm-1處是β-糖苷鍵的特殊吸收峰;α-糖苷鍵在859.6cm-1處具有特定的吸收峰，表明在水提粗多糖中存在β-糖苷鍵和α-糖苷鍵.

3.4 甘草多糖對(duì)羥自由基清除能力的活性研究

我們探討了甘草多糖對(duì)羥自由基的清除能力，原理為在Fe2+存在時(shí)，與H2O2可生成·OH的同時(shí)還生成Fe3+，反應(yīng)方式如下：H2O2+Fe2+→·OH+OH-+Fe3+，而·OH又可使翻紅花紅T褪色，基于以上原理可通過分光光度計(jì)法來檢測(cè)甘草多糖對(duì)羥自由基清除能力.本研究提取的四種甘草多糖各試樣的清除羥自由基能力見表2，對(duì)應(yīng)EC50值的大小見圖3.

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，EC50由小到大排列依次為1級(jí)多糖>粗多糖>2級(jí)多糖（EC50）>3級(jí)多糖（EC50）>抗壞血酸（EC50），由上述結(jié)果可知提取的多糖的羥自由基清除能力強(qiáng)于對(duì)照品（抗壞血酸）.同時(shí)，也表明隨著甘草水提分級(jí)的增加，羥自由基的清除能力降低.

本研究也探討了加入甘草多糖對(duì)醬油試樣的羥基自由基清除能力的影響，結(jié)果表明，加入甘草多糖后醬油試樣對(duì)羥基的清除能力明顯的增強(qiáng).

4 結(jié)論

本文是以甘草為原料，采用水提醇沉法提取了甘草多糖后對(duì)甘草多糖進(jìn)行分級(jí)，分別得到水提一級(jí)、二級(jí)，三級(jí)糖.用紫外、紅外等方法對(duì)提取的多糖進(jìn)行了表征，根據(jù)芬頓反的原理研究了所制備的甘草多糖清除羥自由基的能力，并在醬油試樣中添加提取的多糖后，研究了其羥基自由基清除能力，結(jié)果表明，加入甘草多糖的醬油試樣對(duì)羥基的清除能力有明顯的增強(qiáng).

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