胡好 江亭 方義軍 傅雅娟

摘? ?要：線粒體是真核細(xì)胞中具有重大作用的細(xì)胞器，在調(diào)控細(xì)胞凋亡等方面也發(fā)揮著重要作用。一旦線粒體受到損傷且無法發(fā)揮其正常功能，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化，最終導(dǎo)致組織、器官損傷病變，尤其對(duì)能量要求較高的一些組織或者器官影響很大。希望探索線粒體損傷機(jī)制，減少線粒體損傷及其影響。通過疊氮化鈉建立線粒體損傷模型，并通過檢測(cè)疊氮化鈉刺激后細(xì)胞中腺嘌呤核苷三磷酸水平以及線粒體膜電位變化情況等方法證實(shí)建立的線粒體損傷模型是有效的，可用于線粒體損傷機(jī)制的研究。成功使用疊氮化鈉刺激L929細(xì)胞系建立線粒體損傷模型，并在離體線粒體損傷中檢測(cè)到mtDNA的釋放。疊氮化鈉使用的最佳質(zhì)量濃度會(huì)對(duì)線粒體產(chǎn)生損傷，并影響其正常功能，且對(duì)細(xì)胞活率影響不大。

關(guān)鍵詞：疊氮化鈉;線粒體損傷;線粒體

線粒體是真核生物細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，通過有氧呼吸為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，產(chǎn)生活性氧，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等合作維持細(xì)胞中鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡[1]，通過控制膜電位調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡。所以一旦線粒體損傷會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)造成很大的影響，會(huì)影響腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生過多的氧自由基，使得線粒體膜電位發(fā)生變化、功能紊亂，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在植物中，線粒體功能障礙與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有直接聯(lián)系[2]。植物線粒體中的物質(zhì)運(yùn)輸、呼吸作用等對(duì)能量需求極高，能量的供應(yīng)直接影響整個(gè)植物的生命活動(dòng)[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，線粒體涉及細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等各個(gè)方面。線粒體功能衰退導(dǎo)致氧自由基大幅度增加，使得細(xì)胞衰老;線粒體的結(jié)構(gòu)、功能以及數(shù)目的異常會(huì)引發(fā)心肌能量代謝異常[4]，線粒體自噬在心肌缺血的作用也逐漸引起研究學(xué)者的注意;1996年，Varming[5]利用疊氮化鈉誘發(fā)的線粒體損傷模型篩選潛在的神經(jīng)保護(hù)的化合物。在細(xì)胞環(huán)境中加入疊氮化鈉希望造成線粒體損傷，成功建立線粒體損傷模型，有利于了解線粒體損傷發(fā)生的機(jī)制、了解線粒體疾病發(fā)病機(jī)制，篩選治療線粒體損傷疾病的治療藥物。

1? ? 材料與方法

1.1? 主要試劑

主要試劑如表1所示。

1.2? 細(xì)胞生存率的測(cè)定

將L929細(xì)胞以合適密度鋪在96孔板中，過夜培養(yǎng)，12 h后加入10 μL不同質(zhì)量濃度疊氮化鈉刺激，對(duì)照組加10 μL磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）。放入培養(yǎng)箱一段時(shí)間后，使得疊氮化鈉進(jìn)入細(xì)胞并造成損傷，每孔各添加20 μL MTT溶液，孵育4 h，有活性的琥珀酸脫氫酶可將MTT還原得到甲瓚，藍(lán)紫色結(jié)晶沉淀。之后吸取上清，在96孔板中每孔添加200 μL DMSO用于溶解甲瓚。最后使用酶標(biāo)儀讀取波長490處甲瓚的OD值。死細(xì)胞中沒有還原甲瓚，通過這種方式判斷細(xì)胞生存率。

1.3? 線粒體膜電位的測(cè)定

同上步驟，將載玻片洗干凈固定并加入細(xì)胞過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。第二天更換培養(yǎng)基并加不同質(zhì)量濃度疊氮化鈉刺激?？瞻讓?duì)照加同等體積PBS緩沖液，陽性對(duì)照加入碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙（CCCP），共孵育6 h，用PBS洗滌一次后，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基和1 mL的JC-1染色工作液，37 ℃孵育20 min完成后，使用染色緩沖液清洗，最后使用多聚甲醛固定，用熒光共聚焦顯微鏡觀察。若是觀察到大批紅光，判斷線粒體膜電位正常;若觀察到綠光，則判斷線粒體膜電位不正常。

1.4? 三磷酸腺苷含量的測(cè)定

首先，將L929細(xì)胞鋪于6孔板中，饑餓處理12 h后，加入不同質(zhì)量濃度疊氮化鈉刺激細(xì)胞，刺激6 h后破碎細(xì)胞，從上清中提取其中ATP，并使用試劑盒中裂解緩沖液稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品混勻，保持低溫，用酶標(biāo)儀檢測(cè)相對(duì)光單位（relative light unit，RLU）值。最后計(jì)算ATP質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5? 小鼠肝臟線粒體體外損傷

本實(shí)驗(yàn)選擇易于得到的小鼠肝臟作為線粒體來源，肝臟細(xì)胞內(nèi)含有大量線粒體。將小鼠麻醉，快速取出肝臟，剪掉多余組織，用手術(shù)刀快速切成小的薄片，使用勻漿緩沖液沖洗表面血色，在Dounce勻漿器中制備組織勻漿。勻漿結(jié)束后，1 300 g離心10 min，取上清，再次離心，重復(fù)幾次后，吸出上清，置于冰上保存，最后使用17 000 g高速離心15 min使線粒體沉淀，棄去上清，用緩沖液漂洗線粒體3遍。

實(shí)驗(yàn)需要得到純線粒體，需要上步得到的線粒體去掉雜質(zhì)，首先將線粒體儲(chǔ)液低速離心，此時(shí)沉淀是含有大量雜質(zhì)的線粒體，使用15%的percoll溶液重懸，使用吸管小心加到40% percoll上，利用密度梯度離心5 000 g離心25 min，純線粒體位于15%和40% percoll界面之間，小心吸出，17 000 g離心10 min，使用少量測(cè)試緩沖液重懸沉淀，得到的即是純線粒體。將純線粒體均分成3份，分別加入PBS緩沖液和疊氮化鈉（50 mmol/L）置于37 ℃培養(yǎng)箱反應(yīng)15 min，取出后將線粒體離心沉淀，檢測(cè)上清液中核DNA和mtDNA的表達(dá)。

2? ? 結(jié)果與討論

2.1? 疊氮化鈉刺激L929細(xì)胞后降低細(xì)胞活率

使用MTT的傳統(tǒng)方法檢測(cè)疊氮化鈉刺激細(xì)胞后細(xì)胞數(shù)量的變化。通過加入不同質(zhì)量濃度的疊氮化鈉與L929細(xì)胞共孵育，在不同時(shí)間檢測(cè)疊氮化鈉對(duì)L929細(xì)胞的影響，判斷疊氮化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，則無法對(duì)線粒體造成損傷，若質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，則細(xì)胞死亡過多。通過結(jié)果可以看出，200 mmol/L的疊氮化鈉與L929細(xì)胞共孵育6 h后，細(xì)胞存活率幾乎降到10%，50 mmol/L和100 mmol/L疊氮化鈉刺激對(duì)細(xì)胞活率的影響較為接近。

2.2? NaN3刺激L929細(xì)胞后線粒體膜電位的變化

線粒體功能的正常實(shí)施必須具備有效的線粒體膜電位，使用JC-1探針檢測(cè)使用疊氮化鈉刺激后細(xì)胞膜電位是否變化，其中，CCCP為陽性刺激物，可在較短時(shí)間內(nèi)顯著性損傷線粒體膜電位。由圖2可以看出control組JC-1聚合物比列較高，觀察到強(qiáng)烈紅光，而CCCP對(duì)照組和50 mmol/L疊氮化鈉處理組的紅光都很弱，判斷疊氮化鈉對(duì)線粒體的膜電位造成了顯著性損傷。

2.3? NaN3刺激L929細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)ATP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

本實(shí)驗(yàn)采用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同質(zhì)量濃度疊氮化鈉處理后細(xì)胞內(nèi)ATP總量的變化。表2—3分別為ATP標(biāo)準(zhǔn)品和疊氮化鈉處理組的RLU讀數(shù)。從圖3—4可以看出，隨著疊氮化鈉刺激質(zhì)量濃度的升高，L929細(xì)胞ATP的合成能力下降。

2.4? NaN3刺激離體線粒體

經(jīng)percoll分離獲得的小鼠肝臟線粒體，均分兩份，并重懸于緩沖溶液中，分別加入疊氮化鈉和等體積PBS。如圖5—6所示，用50 mmol/L的疊氮化鈉處理離體線粒體后，有大量的mtDNA釋放到線粒體外。

3? ? 結(jié)語

線粒體作為真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，一旦線粒體損傷，無法正常發(fā)揮功能，對(duì)細(xì)胞的自身影響巨大。有研究報(bào)道，在過去的20年中，線粒體DNA（mtDNA）的突變已成為人類遺傳疾病的主要原因。臨床上，這種疾病在10 000名成年人中有1名，但在200個(gè)背景人群中有1個(gè)發(fā)現(xiàn)了致病性突變。已有大量研究證實(shí)，疊氮化鈉可以有效抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV，抑制ATP合成、超氧化歧化酶和DNA合成酶的活性。

使用疊氮化鈉進(jìn)行線粒體損傷模型，使用疊氮化鈉刺激后會(huì)對(duì)細(xì)胞活率造成影響，使用MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的疊氮化鈉對(duì)細(xì)胞活率的影響，在使用疊氮化鈉刺激時(shí)減小對(duì)細(xì)胞活率的影響;通過檢測(cè)細(xì)胞ATP的方法觀察隨著疊氮化鈉的濃度升高，細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著下降;激光共聚焦顯示，50 mmol/L質(zhì)量濃度疊氮化鈉對(duì)細(xì)胞造成了線粒體的明顯損傷，膜電位極性不正常。以上證實(shí)線粒體損傷模型的建立是成功的。另外，在損傷模型中發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷后，會(huì)有mtDNA釋放到胞質(zhì)中，這是因?yàn)閙tDNA沒有組蛋白的保護(hù)，對(duì)氧自由基引發(fā)的氧化損傷極為敏感，線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致電子傳遞鏈中電子泄露，電子泄露引起氧自由基釋放，mtDNA沒有組蛋白的保護(hù)在高變區(qū)極易斷裂進(jìn)而釋放到線粒體外。本實(shí)驗(yàn)探索了一個(gè)合適的線粒體損傷條件，這對(duì)研究線粒體損傷機(jī)制尤為重要。

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