肖朝江 沈怡 徐偉 劉子琦 彭俊霖 張小東 董相 姜北

摘 要： 瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道每年有數(shù)十萬(wàn)人因瘧疾而死亡，我國(guó)瘧疾防治工作雖然取得了長(zhǎng)足發(fā)展，但在中國(guó)云南邊境地區(qū)和中國(guó)西藏林芝地區(qū)本地瘧疾病例依然存在，再加上西藏自治區(qū)和云南省地理位置特殊，與周邊瘧疾高發(fā)的國(guó)家接壤，邊民來(lái)往十分頻繁，傳染源輸入無(wú)法杜絕。為了發(fā)現(xiàn)植物來(lái)源的新型抗瘧疾天然產(chǎn)物，該研究依次用75%乙醇和蒸餾水對(duì)30種滇西植物進(jìn)行回流提取，并采用β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)這些樣品進(jìn)行抗瘧活性篩選。結(jié)果表明：在供試的30種植物中，玉葉金花、回心草以及云南甘草等19種植物粗提物具有不同程度的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，具有抗瘧活性的植物種類涉及17個(gè)科、19個(gè)屬。其中，蝦子花、東方紫金牛、姜花水提物以及反瓣老鸛草地下部分醇提物的活性較好，其IC50值分別為796.0、951.0、1 033.0、1 388.9 μg·mL-1，值得進(jìn)一步深入研究。蝦子花、東方紫金牛的HPLC分析結(jié)果顯示，其活性成分應(yīng)為酚性成分。

關(guān)鍵詞： 滇西， 植物， 抗瘧活性， β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)， HPLC

中圖分類號(hào)： Q946， R285.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2019）07-0863-10

Abstract： Malaria is a parasitic disease that seriously endangers human health. According to the world health organization， hundreds of thousands of people died due to malaria each year. Although the prevention and treatment of malaria in China has made great progress， the local malaria cases still exist in the border areas of Yunnan and Nyingchi of Tibet， China. In addition to the special geographical locations of Tibet and Yunnan， China shares borders with neighboring countries with high incidence of malaria， and the border residents have frequent contacts， so the source of infection cannot be eliminated. Therefore， the situation of malaria prevention and control in China is still not optimistic. To explore the novel antimalarial natural products from plant， thirty plants from West Yunnan were extracted by reflux method with 75% ethanol and water， successively. Then the antimalarial activities of the samples were tested by β-hematin formation inhibition assay. As a result， Mussaenda pubescens， Rhodobryum roseum， Glycyrrhiza pallidiflora and other 19 testing samples showed β-hematin formation inhibition activity in different degrees， which came from 17 families and 19 genera. Among the active samples， the water extracts of Woodfordia fruticosa， Ardisia elliptica and Hedychium coronarium， as well as the ethanol extract of Geranium refractum， showed significant inhibition activities with the IC50 values of 796.0， 951.0， 1 033.0， 1 388.9 μg·mL-1， respectively. HPLC analysis of Woodfordia fruticosa and Ardisia elliptica indicated that their active components should be phenolic constituents.

Key words： West Yunnan， plants， anti-malarial activity， β-hematin formation inhibition assay， HPLC

瘧疾是一種由瘧原蟲引起的嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全世界91個(gè)瘧疾流行國(guó)家和地區(qū)2016年共有2.16億瘧疾病例，因瘧疾死亡人數(shù)達(dá)44.5萬(wàn)。其中，90%的瘧疾病例和91%的死亡病例發(fā)生在撒哈拉以南的非洲地區(qū)，7%的瘧疾病例和6%的死亡病例發(fā)生在東南亞地區(qū)（World Health Organization， 2017a）。另外，2014年全球瘧疾病例為2.1億例，2015年為2.11億例，2016年為2.16億例，明顯呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)（World Health Organization， 2017a）。在我國(guó)，經(jīng)過(guò)幾代人的努力，從建國(guó)初期瘧疾發(fā)病人數(shù)高達(dá)3 000萬(wàn)例到2016年的3 321例來(lái)看，我國(guó)瘧疾防治工作取得了顯著成效（張麗等， 2017）。雖然我國(guó)瘧疾防治工作取得了長(zhǎng)足發(fā)展，并且2016年99.9%的瘧疾病例為境外輸入性病例，但在云南邊境地區(qū)和西藏林芝地區(qū)本地瘧疾病例依然存在（張麗等， 2017）。加上中國(guó)的西藏自治區(qū)和云南省地理位置特殊，與印度、尼泊爾、緬甸和越南等周邊瘧疾高發(fā)的南亞、東南亞國(guó)家接壤，邊民來(lái)往十分頻繁，傳染源輸入無(wú)法杜絕。因此，我國(guó)瘧疾防控形勢(shì)依然不容樂(lè)觀。

目前，臨床用于治療瘧疾的藥物主要為奎寧和青蒿素兩類（World Health Organization， 2010， 2015）。由于長(zhǎng)期使用氯喹和青蒿素，其瘧原蟲抗藥株已逐步顯現(xiàn)（Imwong et al.， 2017; Price et al.， 2014; World Health Organization， 2017b）。因此，研發(fā)新一代抗瘧藥物對(duì)瘧原蟲病防治工作意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，游離血紅素對(duì)瘧原蟲有毒性，瘧原蟲通過(guò)將血紅素轉(zhuǎn)換成瘧原蟲色素（β-羥高鐵血紅素）的方式解毒（Orjih et al.， 1981; Pagola et al.， 2000; Slater et al.， 1991）。與此同時(shí)，奎寧等紅內(nèi)期抗瘧藥可與血紅素絡(luò)合從而抑制β-羥高鐵血紅素形成，成為紅內(nèi)期抗瘧藥物的作用靶點(diǎn)之一（Chong & Sullivan Jr， 2003）。因此，本研究采用β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)30種滇西植物進(jìn)行抗瘧活性篩選，并對(duì)活性較好的植物樣品進(jìn)行初步的HPLC分析，以期能發(fā)現(xiàn)若干種活性較強(qiáng)的植物，為尋找和開發(fā)繼奎寧、青蒿素之后的第三代植物來(lái)源的新型抗瘧天然產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：氯高鐵血紅素、氯喹二磷酸鹽、HEPES均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;吡啶、冰醋酸均購(gòu)于上海申博化工有限公司;乙酸鈉購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二甲基亞砜購(gòu)于天津化學(xué)試劑有限公司;色譜甲醇購(gòu)于Fisher Chemical公司;HPLC用水為市售娃哈哈礦泉水。

儀器：BioTek Synergy HT多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)BioTek儀器公司生產(chǎn);MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱為日本三洋公司生產(chǎn);AL204電子天平為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn);EYELA FDU-2100冷凍干燥機(jī)為日本東京理化器械株式會(huì)社生產(chǎn);RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器為上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);Agilent 1260高效液相色譜儀為美國(guó)安捷倫科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 植物樣品

30種植物樣品（表1）均于2013年采自滇西地區(qū)，由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥教研室張德全博士鑒定，植物標(biāo)本均存放于大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院姜北教授研究組。

1.3 植物提取物的制備

取約50 g干燥的植物樣品粉碎，依次用75%乙醇、蒸餾水熱回流提取。處理過(guò)程：（1）用75%乙醇回流提取3次（每次250 mL），將3次提取的溶液合并后在50 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分溶劑，之后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)上充分干燥。（2）經(jīng)75%乙醇提取過(guò)的植物殘?jiān)^續(xù)用蒸餾水回流提取3次，合并提取液蒸餾近干，之后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)上充分干燥。（3）精密稱取上述植物提取物浸膏干粉5.0 mg，以1 mL蒸餾水溶解得相應(yīng)溶液，之后用水按比例（1∶4）稀釋成系列濃度溶液備用。植物提取率以凍干粉重量除以提取植物樣品干重后乘以100%計(jì)算。

1.4 β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)

參照肖朝江等（2014）對(duì)30種滇西植物進(jìn)行β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)試的方法。將50 μL不同濃度的供試樣品和50 μL氯高鐵血紅素儲(chǔ)備液（1.0 mmol·mL-1，溶解于DMSO中）混合于96孔板中，一式3份;同時(shí)，設(shè)置蒸餾水陰性對(duì)照和氯喹二磷酸鹽陽(yáng)性對(duì)照。之后每孔加入80 μL的醋酸鹽緩沖液（4 mol·mL-1，pH 5.0），置于50 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h;取出待室溫后，每孔加入100 μL 30%（v/v）的吡啶-HEPES溶液（20 mmol·mL-1，pH 7.5）使微孔板中固體混懸;室溫放置待未反應(yīng)的羥高鐵血紅素溶解完全后，從每孔中精密移取50 μL上清液至另一96孔板中，之后均以200 μL上述吡啶-HEPES溶液稀釋，并于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。由羥高鐵血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未反應(yīng)的羥高鐵血紅素的濃度，從而計(jì)算出供試品對(duì)β-羥高鐵血紅素形成的抑制濃度（以IC50表示）。

1.5 HPLC分析方法

色譜柱為phenomenex C18 （250 mm×4.60 mm， 5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，體積流量1 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃。蝦子花提取物洗脫程序：水（A）-甲醇（B）：0～40 min，0%～35% B;40～50 min，35%～70% B;50～60 min，70%～100% B;60～70 min，100% B。東方紫金牛提取物洗脫程序：水（A）-甲醇（B）：0～30 min，0%～25% B;30～40 min，25%～50% B;40～50 min，50%～60% B;50～60 min，60%～100% B。

2 結(jié)果與分析

熱回流提取實(shí)驗(yàn)（表1）表明，30種滇西產(chǎn)植物75%乙醇的平均提取率為21.7%，最高為39.0%（高河菜）;水的平均提取率為5.1%，最高為9.2%（拔毒散）。

抗瘧活性篩選結(jié)果（表2）表明，30種滇西植物中蝦子花、東方紫金牛、姜花、反瓣老鸛草、拔毒散、高河菜、滇黃芩、土香薷、曲苞芋、接骨木、云南貫眾、四翅月見草、西南委陵菜、玉葉金花、木芙蓉、回心草、瑞香狼毒、小苞黃芪和云南甘草19種植物具有不同程度的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性。其中，蝦子花、東方紫金牛、姜花水提物以及反瓣老鸛草地下部分醇提物的活性較好，其IC50值分別為796.0、951.0、1 033.0、1 388.9 μg·mL-1。此外，本實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的活性植物涉及千屈菜科、紫金?？?、牻牛兒苗科等17個(gè)科，蝦子花屬、老鸛草屬等19個(gè)屬。

運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（版本19.0）進(jìn)行兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，玉葉金花和回心草水提物以及云南甘草醇提物與陽(yáng)性對(duì)照氯喹二磷酸鹽對(duì)β-羥高鐵血紅素形成抑制活性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

兩種活性較好的植物樣品蝦子花、東方紫金牛乙醇提取物、水提物的HPLC分析結(jié)果如圖1和圖2所示。根據(jù)圖1和圖2兩個(gè)樣品譜圖中主要成分a-f峰的相關(guān)在線UV譜圖，其為酚性成分的可能性極大，這與兩種植物化學(xué)成分的研究報(bào)道結(jié)果相一致（Das et al.， 2007; Mishra & Aeri， 2017; Okuda et al.， 2006）。同時(shí)，鑒于兩種植物樣品水提物表現(xiàn)出較好的活性，d、f兩個(gè)峰應(yīng)為其重要的活性成分，值得注意。

3 討論

隨著瘧原蟲對(duì)奎寧類和青蒿素類抗瘧藥物耐藥性的發(fā)現(xiàn)（Imwong et al.， 2017; Price et al.， 2014; World Health Organization， 2017b），研發(fā)全新的抗瘧藥物已刻不容緩。目前，抗瘧疾藥物的研發(fā)主要通過(guò)對(duì)活性先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，或者合成其結(jié)構(gòu)類似的衍生物的方式進(jìn)行（Jampilek， 2017; Vangapandu et al.， 2007）。雖然這種研發(fā)模式有一定的效果，但由于人工合成的化合物往往具有較大的毒副作用或與先導(dǎo)化合物具有相似作用機(jī)制而容易產(chǎn)生耐藥性等因素，致使最終能應(yīng)用于臨床的抗瘧藥物寥寥無(wú)幾。盡管近些年來(lái)抗瘧疫苗已問(wèn)世，但要應(yīng)用到臨床還需要很長(zhǎng)一段時(shí)間（Birkett et al.， 2013; Matuschewski， 2017）。此外，一些植物來(lái)源的非奎寧類和青蒿素類天然產(chǎn)物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)具有抗瘧疾活性（Kayser et al.， 2002; Mojab， 2012; Pohlit et al.， 2013; Xu & Pieters， 2013），且目前所篩選的植物種類與浩瀚的植物種類相比僅冰山一角。因此有理由相信，從植物中尋找、發(fā)現(xiàn)抗瘧藥物的可能性非常大，其前景必定廣闊。

β-羥高鐵血紅素形成抑制活性很可能具有化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)類型的選擇關(guān)聯(lián)性，羥基尤其是酚羥基為β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)的主要活性基團(tuán)（肖朝江等， 2016）。近年來(lái)有研究顯示，含有多個(gè)酚羥基的黃酮類成分芹菜素具有顯著的體內(nèi)抗瘧活性，其體內(nèi)抑制伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei）的活性在70 mg·kg-1·day-1時(shí)可達(dá)到70%，效果十分顯著（Amiri et al.， 2018）;本研究對(duì)芹菜素的研究結(jié)果表明，該化合物抑制β-羥高鐵血紅素形成的活性十分顯著，其IC50達(dá)到168 μg·mL-1，從一個(gè)側(cè)面反映了β-羥高鐵血紅素形成抑制活性與酚羥基以及體內(nèi)抗瘧活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)本研究中活性最好的兩種植物樣品的HPLC分析結(jié)果顯示，其主成分均應(yīng)是酚性成分，這進(jìn)一步印證了上述聯(lián)系，值得深入研究。

分析本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試的30種植物中有19個(gè)植物具有不同程度的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，顯示出潛在的抗瘧活性。這些活性植物醇提物的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性總體弱于相應(yīng)水提物的活性，提示抗瘧活性較好的化合物可能為水溶性的、極性偏大的物質(zhì)。本研究30種供試植物涵蓋了21個(gè)科29個(gè)屬，在植物科屬分類范疇方面跨度較大，具有較高的代表性。所篩選出來(lái)的活性植物涉及17個(gè)科、19個(gè)屬，進(jìn)一步證實(shí)了從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)奎寧、青蒿素等抗瘧藥物的合理性，以及今后從中發(fā)現(xiàn)新型抗瘧先導(dǎo)化合物的可行性。因此，本研究為尋找、開發(fā)植物來(lái)源的新型抗瘧天然產(chǎn)物奠定了一定的基礎(chǔ)，并在一定程度上為進(jìn)一步研究上述供試植物提供了參考。

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