趙展平 何芳 唐軍榮 羅旭璐 趙平 黃薦 丁勇

摘 要： 為解決樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）組培苗生根質(zhì)量不佳、移栽成活率低的問題，該研究以樟葉越桔繼代苗為材料，采用單因子試驗(yàn)從激素類型及濃度、培養(yǎng)基類型和蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)其生根的適宜條件進(jìn)行篩選，進(jìn)一步研究了不同基質(zhì)配比對(duì)樟葉越桔移栽苗存活率的影響。結(jié)果表明：激素類型和濃度、培養(yǎng)基類型對(duì)樟葉越桔生根率的影響最大，其次為蔗糖質(zhì)量濃度;最適合樟葉越桔生根的激素及濃度為IBA 2.0 mg·L-1、基本培養(yǎng)基類型為1/4MS、蔗糖質(zhì)量濃度為15 g·L-1，樟葉越桔組培苗最佳生根培養(yǎng)基為1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1 + 活性炭0.1 g·L-1 + 蔗糖15 g·L-1，生根率達(dá)100%，平均生根數(shù)為每株7.67條;根系呈輻射狀、基部無愈傷組織，組培苗生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠;樟葉越桔組培苗移栽時(shí)以全腐殖土基質(zhì)為佳，成活率為83.7%，植株葉片舒展，生長(zhǎng)狀況良好。該研究建立的優(yōu)化體系有效地提高了樟葉越桔組培生根苗的生根率和生根質(zhì)量，解決了后期移栽成活困難的問題，為優(yōu)良的樟葉越桔植株規(guī)?；a(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 樟葉越桔， 激素， 生根， 移栽， 組培苗

中圖分類號(hào)： Q943.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2019）07-0967-09

Abstract： Vaccinium dunalianum is one of the main plant sources for arbutin which is widely used in cosmetic formulations as the natural active agents to whiten the skin. During the tissue culture process of V. dunalianum， the base of the rooting plantlets obtained by the current culture medium often formed the callus， which significantly affected the survival rate after transplantation. In order to improve the rooting quality of the proliferation plantlets and survival rate of the transplanted plantlets of V. dunalianum. The optimum medium components for the root induction of the proliferation plantlets of V. dunalianum， including hormone types and concentrations， medium types and sucrose concentrations， were analyzed by the single factor experiment， and further probed the effects of different substrate ratios on the survival rate of the transplanted V. dunalianum plantlets in this study. The results showed that the medium types and the hormone types and their concentrations had more significant effects on the rooting rate than sucrose concentration. For the root induction， the optimal hormone and its concentration were IBA 2.0 mg·L-1， the optimal media was 1/4MS and the optimal sucrose concentration was 15 g·L-1. The most suitable medium for the root induction of the proliferation plantlets of V. dunalianum was 1/4MS+ IBA 2.0 mg·L-1+ activated carbon 0.1 mg·L-1+ sucrose 15 g·L-1， by which the rooting rate could reach 100%， and the average number of roots was 7.67 per plant. The root system of proliferation plantlets of V. dunalianum was radially extended and none callus was formed at the base of the rooting plantlets. In addition， the tissue culture plantlets of V. dunalianum grew strong and had dark-green leaves. For the transplantation of V. dunalianum plantlets， the optimal media for transplantation was the 100% humus， in which the survival rate reached 83.7%， and the tissue culture plantlets obtained by the experiments grew well and had healthy leaves. The optimization system established by this study， which had effectively improved the roots quality and rooting rate of the proliferation plantlets and the survival rate of the transplanted plantlets of V. dunalianum， and provided scientific and technological support for the large-scale production of high quality V. dunalianum plants.

Key words： Vaccinium dunalianum， hormone， rooting， transplanting， tissue culture plantlet

樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）又名飯米果、長(zhǎng)尾越桔，為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）植物，多年生常綠灌木，生于山坡灌叢、闊葉林下或石灰山灌叢，稀附生常綠闊葉林中樹上，偶成喬木，全株可藥用，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效，我國(guó)主產(chǎn)于云南、四川、貴州、西藏等地（方瑞征，1986）。本課題組研究發(fā)現(xiàn)樟葉越桔是一種富含熊果苷和咖啡酰熊果苷類物質(zhì)的特殊民族資源植物，是廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)的皮膚美白天然活性劑原料熊果苷的主要植物來源之一（Zhao et al.，2008）。樟葉越桔幼嫩葉芽經(jīng)過一系列工藝后在云南彝族民間作為茶代用品飲用，因形似雀嘴呈錐狀，又稱“雀嘴茶”，研究發(fā)現(xiàn)“雀嘴茶”和樟葉越桔陰干果實(shí)中氨基酸種類齊全，含量豐富，且含有豐富的礦質(zhì)元素和營(yíng)養(yǎng)素，有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值（楊芳等，2011;羅旭璐等，2014b）。樟葉越桔花冠淡綠帶紫紅色或淡紅色，還具有一定的觀賞價(jià)值，園林上可用于叢植或行道樹（王麗娜， 2010），同時(shí)在城市綠化上也有廣闊的應(yīng)用前景。

樟葉越桔目前仍處于野生狀態(tài)，加上其原生環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞、植株生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致樟葉越桔野生資源日益匱乏，其種質(zhì)資源保護(hù)利用與優(yōu)良種繁育技術(shù)亟待開發(fā)。常用的林木種苗繁殖方式包括種子繁殖、扦插繁殖和組培繁殖等。有研究者以野生樟葉越桔種子為材料，研究了不同處理方法對(duì)樟葉越桔種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)樟葉越桔種子萌發(fā)率均低于70%（任國(guó)香等，2017），同時(shí)由于缺乏樟葉越桔優(yōu)良家系，種子繁殖易出現(xiàn)性狀分離。采用傳統(tǒng)的扦插繁殖技術(shù)開展樟葉越桔種苗繁育也存在需穗條多、對(duì)母株傷害大、繁殖速度慢等缺點(diǎn)。然而，組培快繁技術(shù)則是一種有效的樟葉越桔植物資源開發(fā)和保護(hù)技術(shù)。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外對(duì)越桔屬多種植物的組培快繁技術(shù)研究已有報(bào)道，使用組培快繁技術(shù)可使藍(lán)莓莖段成活率高達(dá)85.7%，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)88%（房小晶等，2014）;和加衛(wèi)和徐中志（2007）以云南越桔繼代培養(yǎng)的芽苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中，生根率達(dá)78%，煉苗成活率在90%以上。目前，本課題組已就樟葉越桔的組織培養(yǎng)研究開展了一定的基礎(chǔ)工作，一方面以野生樟葉越桔幼嫩帶芽莖段為外植體，建立了樟葉越桔的組織培養(yǎng)與快速繁殖體系，外植體誘導(dǎo)萌發(fā)率為83.33%，生根率為86.67%（羅旭璐等，2014a）;另一方面以樟葉越桔組培苗葉片為研究材料，建立了樟葉越桔葉片誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)體系，并試圖通過定向培養(yǎng)植物細(xì)胞或組織來獲取熊果苷和咖啡酰熊果苷類物質(zhì)等活性次生代謝產(chǎn)物（卜程洪等，2018）。但還沒有開展樟葉越桔生根苗的移栽煉苗研究。同時(shí)前期研究發(fā)現(xiàn)樟葉越桔繼代培養(yǎng)苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中，雖然生根率超過了85%，但并未達(dá)到最佳;同時(shí)，現(xiàn)有生根配方獲得的組培生根苗基部還存在大量愈傷組織，導(dǎo)致移栽成活率低。

組培生根苗的質(zhì)量直接會(huì)影響到移栽苗的成活率，進(jìn)而決定種苗的培育成本，因此采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種苗生產(chǎn)，首先要有完整的組培工藝流程，其次要不斷優(yōu)化工藝流程，以不斷降低生產(chǎn)成本?；诖?，為了進(jìn)一步完善樟葉越桔的組培快繁工藝流程，降低育苗成本，推進(jìn)種苗的工廠化生產(chǎn)進(jìn)程。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，以樟葉越桔繼代苗為材料，從生根激素類型及濃度的比較、基本生根培養(yǎng)基的篩選、糖分濃度的篩選和移栽基質(zhì)配比的篩選開展了研究，旨在提高樟葉越桔組培苗生根率、生根質(zhì)量以及移栽成活率，降低生產(chǎn)成本，為樟葉越桔的優(yōu)良植株的繁育和規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以云南省武定縣產(chǎn)野生樟葉越桔離體培養(yǎng)后的繼代苗為試驗(yàn)材料，由西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的預(yù)處理 將樟葉越桔叢生芽轉(zhuǎn)接在1/2MS + IAA 1.5 mg·L-1+ 活性炭0.1 g·L-1 + 蔗糖20 g·L-1 + 瓊脂5 g·L-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗處理2個(gè)月，獲得壯苗后的樟葉越桔繼代苗，并去除分裂素的影響，再挑選葉色濃綠、生長(zhǎng)健壯、無污染的繼代苗接種在后續(xù)生根培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0;培養(yǎng)溫度為（25 ± 2）℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，每天光照12 h;50 d后統(tǒng)計(jì)生根率;試驗(yàn)于西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.2 不同激素類型及濃度對(duì)樟葉越桔組培苗生根的影響 以1/2MS + 瓊脂5 g·L-1+ 活性炭0.1 mg·L-1+ 蔗糖15 g·L-1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)IBA（1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1），NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1），IAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）共12個(gè)處理，同時(shí)設(shè)置不加激素的空白對(duì)照組。每組處理30瓶，每瓶10顆苗，重復(fù)3次。

1.2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)樟葉越桔組培苗生根的影響 設(shè)置了5種不同的培養(yǎng)基類型，分別為MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS、WPM，其他添加成分有IBA 2.0 mg·L-1、瓊脂5 g·L-1 + 活性炭0.1 mg·L-1、蔗糖15 g·L-1。每組處理30瓶，每瓶10顆苗，重復(fù)3次。

1.2.4 不同糖分含量對(duì)樟葉越桔組培苗生根的影響 以1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1+ 瓊脂5 g·L-1+ 活性炭0.1 mg·L-1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置了4種蔗糖濃度，分別為5、15、25、35 g·L-1。每組處理30瓶，每瓶10顆苗，重復(fù)3次。

1.2.5 不同基質(zhì)配比對(duì)樟葉越桔組培苗移栽成活的影響 將生根培養(yǎng)基上植株健壯，葉片舒展，根系發(fā)達(dá)的生根苗放置移栽環(huán)境中閉瓶處理7 d后，從培養(yǎng)瓶小心取出并沖洗殘留培養(yǎng)基，移栽至煉苗基質(zhì)中。煉苗移栽基質(zhì)設(shè)全腐殖土、紅壤∶腐殖土（1∶1）、紅壤∶腐殖土（2∶1）、紅壤∶腐殖土（4∶1）共4個(gè)處理，每個(gè)處理均全面噴灑多菌靈，澆透水后第2天進(jìn)行移栽，期間保證其空氣溫度不高于30 ℃，每個(gè)處理移栽50株樟葉越桔生根苗，重復(fù)3次，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)其成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行顯著性分析。按照下列公式計(jì)算生根率和成活率：

生根率=（生根苗數(shù)/接種的總苗數(shù)）×100%;

成活率=（移栽后成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)）×100%。

根據(jù)觀察根系發(fā)達(dá)、粗壯的程度把組培苗生根狀況描述為生根良好、生根較好、生根較差和生根差四個(gè)等級(jí)，表中“生根良好”記為“++++”，“生根較好”記為“+++”，“生根較差”記為“++”，“生根差”記為“+”。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素類型及濃度對(duì)樟葉越桔組培苗生根影響

從表1可以看出，對(duì)照組的組培苗未生根，不同IAA濃度處理的組培苗生根效果有差異但不顯著，根的數(shù)量少，基部少量愈傷組織，其最高生根率為73.33%。不同濃度NAA處理下的組培苗生根率在隨著NAA濃度的增加逐漸提高，在NAA 2.0 mg·L-1處理下生根率達(dá)到80.00%，根系也隨之變得發(fā)達(dá)、粗壯，但根的數(shù)量少，基部有大量愈傷組織。不同濃度IBA處理的組培苗生根效果呈現(xiàn)顯著差異，隨著IBA濃度的升高，組培苗生根率呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，在IBA 2.0 mg·L-1處理下其生根率達(dá)到最高，為81.67%，樟葉越桔的生根效果也最佳，根系發(fā)達(dá)、粗壯，呈輻射狀，基部無愈傷組織，植株葉片舒展（圖1，圖2）。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)樟葉越桔組培苗生根影響

從表2可以看出，不同培養(yǎng)基處理的樟葉越桔組培苗生根率存在顯著性差異。其中：1/4MS培養(yǎng)基處理的組培苗生根率最高（達(dá)97.22%），根系數(shù)量多且粗壯，植株生長(zhǎng)健壯（圖3，圖4）;其次是1/2MS的培養(yǎng)基，生根率達(dá)到81.67%，生根數(shù)量也較多，植株生長(zhǎng)也較好。其他培養(yǎng)基處理的組培苗根系則較細(xì)、生根率較低、植株生長(zhǎng)較弱。

2.3 不同糖分濃度對(duì)樟葉越桔組培苗生根影響

從表3可以看出，添加5～35 g·L-1蔗糖后，各處理組生根率均較高，其中蔗糖15 g·L-1處理下的組培苗生根率最高（達(dá)到100%），而且根數(shù)量也最多，長(zhǎng)度最長(zhǎng)，呈輻射狀，苗生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠（圖5，圖6）。

2.4 不同基質(zhì)配比對(duì)樟葉越桔組培苗移栽成活影響

從表4可以看出，把樟葉越桔生根苗移栽入不同基質(zhì)進(jìn)行移栽馴化，發(fā)現(xiàn)移栽成活率隨著紅土比值的加大而逐漸降低，長(zhǎng)勢(shì)也越來越差。最適的基質(zhì)為全腐殖土，成活率最高（達(dá)到83.7%），且葉片舒展，生長(zhǎng)狀況良好（圖7）。

3 討論與結(jié)論

本研究通過分析不同激素類型及濃度、培養(yǎng)基類型和糖質(zhì)量濃度等因素對(duì)樟葉越桔組培苗生根的誘導(dǎo)影響，獲得樟葉越桔理想的生根培養(yǎng)基配方為1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1 + 活性炭0.1 mg·L-1 + 蔗糖15 g·L-1，生根率最高可達(dá)100%;并進(jìn)一步研究了不同基質(zhì)配比對(duì)樟葉越桔移栽苗存活率的影響，得出樟葉越桔組培苗移栽時(shí)以全腐殖土基質(zhì)為佳，成活率達(dá)83.7%。

在植物組培快繁過程中，組培苗的生根及煉苗移栽是該工藝流程中最后兩個(gè)核心環(huán)節(jié)。生根苗質(zhì)量的好壞直接影響到后期的煉苗移栽，而移栽成活率的高低則直接影響組培快繁的生產(chǎn)成本。在組培苗的生根過程中，激素的類型及濃度對(duì)根系的形成最為關(guān)鍵。Ikeuchi et al.（2016）研究發(fā)現(xiàn)，植物能夠再生缺失的組織和器官，通過激素誘導(dǎo)可加快再生進(jìn)程。生長(zhǎng)素對(duì)不定根的誘導(dǎo)效果在不同的植物中表現(xiàn)不同（Abdulaziz & Bahrany，2002）。生長(zhǎng)素IBA和NAA對(duì)不定根的誘導(dǎo)比生長(zhǎng)素IAA要穩(wěn)定（AI-Juboory et al.，1998），有研究證明在多種植物中IBA對(duì)不定根的誘導(dǎo)作用效果較好（Prakash et al.，1999;Rani & Grover，1999;Fracro & Echeverrigaray，2001）。本研究比較了一定濃度范圍內(nèi)的IAA、NAA和IBA三種激素對(duì)樟葉越桔組培苗生根的影響，結(jié)果表明IAA和NAA處理的樟葉越桔生根苗基部會(huì)存在大量愈傷組織，而IBA處理的樟葉越桔生根苗基部無愈傷組織，生根質(zhì)量好，且生根率有隨著IBA濃度的升高先增加達(dá)到峰值后再降低的變化規(guī)律，這與野含笑（曹基武等，2015）、藍(lán)莓（韓德偉，2013）和篤斯越橘（王振武等，2015）等植物的變化規(guī)律類似。本研究表明IBA濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，樟葉越桔組培苗生根率最高且根系發(fā)達(dá)，該IBA最適濃度高于前期課題組誘導(dǎo)樟葉越桔葉片產(chǎn)生不定根的IBA最適濃度1.0 mg·L-1 IBA（卜程洪等，2018），推測(cè)樟葉越桔組培苗的莖和葉片響應(yīng)IBA誘導(dǎo)生根的敏感度存在一定的差異。另外，本試驗(yàn)只研究了不同單一激素及濃度對(duì)樟葉越桔組培苗生根的影響，為了降低樟葉越桔組培快繁生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提高組培苗的生根質(zhì)量，后續(xù)可從多種激素組合及其濃度對(duì)樟葉越桔組培苗生根的影響開展深入研究。

大量元素在對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著極其重要的作用，除氮元素外，磷、鉀、鈣、鎂等元素都對(duì)植物細(xì)胞酶活性有一定影響，在植物新陳代謝過程中起著重要作用。程磊和胡宋英（2003）研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Ca2+和Mg2+有助于誘導(dǎo)根的形成和生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明1/4MS培養(yǎng)基處理的樟葉越桔組培苗生根率高、生根效果最好，MS培養(yǎng)基處理下的樟葉越桔組培苗不生根，推測(cè)是高濃度的大量元素（如Ca2+和Mg2+）對(duì)樟葉越桔組培苗生根有抑制作用。鄭小江和劉金龍（2001）在對(duì)天師栗莖芽組織培養(yǎng)研究中，也發(fā)現(xiàn)高濃度的無機(jī)鹽對(duì)生根有明顯的抑制作用。而1/8MS培養(yǎng)基較1/4MS培養(yǎng)基處理下的樟葉越桔組培苗生根率又有所下降，推測(cè)過低濃度的大量元素又無法滿足組培苗生根的營(yíng)養(yǎng)需求，這與劉正娥等（2012）的研究結(jié)果類似。前期羅旭璐等（2014a）研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)WPM是最適宜培養(yǎng)基，生根率為86.67%，而本研究結(jié)果顯示W(wǎng)PM培養(yǎng)基處理下的樟葉越桔組培苗生根率只有12.78%，且其根系生長(zhǎng)差，原因可能與本研究中樟葉越桔組培苗生根處理前進(jìn)行的壯苗處理有關(guān)，其中的內(nèi)在機(jī)理還需要進(jìn)一步深入研究。

糖作為組培苗生命活動(dòng)的碳源和能源物質(zhì)，同時(shí)具有調(diào)節(jié)滲透壓和提高植物耐鹽性的作用（劉麗萍，2006;龔建英，2019）。蔗糖在植物組織培養(yǎng)中得到了廣泛的應(yīng)用，既可為植物生長(zhǎng)提供能源，又可促進(jìn)植物組織分化。有研究發(fā)現(xiàn)蔗糖對(duì)植物根的生長(zhǎng)有一定的調(diào)節(jié)作用，嚴(yán)華兵等（2011）發(fā)現(xiàn)高蔗糖濃度能促進(jìn)不定根的發(fā)生，張碩等（2012）卻發(fā)現(xiàn)蔗糖對(duì)小麥根的生長(zhǎng)具有抑制作用，而De Faria et al.（2004）研究則表明不同蔗糖濃度對(duì)體外培養(yǎng)的石斛生根影響較小。本研究結(jié)果顯示不同蔗糖濃度處理的樟葉越桔組培苗生根率均高于85%，表明蔗糖濃度對(duì)樟葉越桔組培苗生根的影響較小?？梢?，蔗糖對(duì)植物組培苗根的生長(zhǎng)影響因物種不同而不同。研究還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭，既可吸附植物細(xì)胞分泌的毒性物質(zhì)以及培養(yǎng)基中有毒副作用的物質(zhì)，也可為根的生長(zhǎng)營(yíng)造近似自然生長(zhǎng)條件下的暗環(huán)境，因此，在生根培養(yǎng)基中添加活性炭可有利于生根（劉根林等，2001;張文泉等，2015;馮漢青等，2016）。

越桔屬植物根系較弱，沒有側(cè)根，組培苗移栽階段較難成活（梁曉晶等，2011），因此對(duì)基質(zhì)的要求也較高。在組培苗移栽過程中，基質(zhì)起著支持和固定植物的作用，為植物提供相對(duì)適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。不同基質(zhì)的保濕性、透氣性和抗菌性等能力不同。樟葉越桔與藍(lán)莓（董朝莉，2011）、蔓越橘（張麗華，2012）、紅豆越橘（田新華等，2015）等同為越桔屬植物，比較適合生長(zhǎng)在疏松多孔、富含有機(jī)質(zhì)、酸性的人工基質(zhì)中。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用全腐殖土處理的樟葉越桔組培苗移栽效果最好，煉苗成活率達(dá)83.7%，推測(cè)全腐殖土富含有機(jī)質(zhì)且土質(zhì)疏松透氣，利于植物幼苗生長(zhǎng)。此外，由于試管苗從高濕恒溫的無菌環(huán)境轉(zhuǎn)移到低濕變溫的有菌環(huán)境，適應(yīng)能力較弱（黃卓忠和嚴(yán)華兵，2007），因此，對(duì)環(huán)境的要求非常嚴(yán)苛，除對(duì)選用的移栽基質(zhì)采取常規(guī)消毒處理外，移栽后的管護(hù)同樣尤為重要，嚴(yán)格控制好溫濕度，否則極易造成移栽苗死亡。

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