楊鈺慧 謝佳燕 吳聰

摘要：【目的】采用線粒體COI基因序列分析武漢地區(qū)常見麥蚜蚜種的遺傳組成，探討基于COI基因序列作為常見麥蚜蚜種分子鑒定的可行性，為田間麥蚜的有效識別和綜合治理提供科學(xué)依據(jù)。【方法】采集武漢市田間和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的3種麥蚜（禾谷縊管蚜、麥長管蚜和麥二叉蚜），擴(kuò)增其COI基因后進(jìn)行測序，并進(jìn)行遺傳距離檢測及聚類分析?！窘Y(jié)果】3種麥蚜COI基因片段核苷酸組成中堿基C和G的總含量低于堿基A和T的總含量，其中含量最低的堿基為G，具有明顯的堿基偏倚性;不同麥蚜的種內(nèi)遺傳距離均小于0.010，種間遺傳距離約是種內(nèi)遺傳距離的10倍;聚類分析結(jié)果表明，蚜科的所有物種聚為一支，之后又形成3個(gè)分支，分屬于蚜科的3種麥蚜?！窘Y(jié)論】3種麥蚜的分子鑒定與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，表明采用COI基因序列可對武漢地區(qū)常見麥蚜蚜種進(jìn)行有效鑒定。

關(guān)鍵詞： 麥蚜;COI基因序列;物種鑒定;蚜科

中圖分類號： S435.122.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1742-06

Identification of wheat aphid species in Wuhan based on mitochondrial COI gene sequence

YANG Yu-hui， XIE Jia-yan*， WU Chong

（School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan? 430023， China）

Abstract：【Objective】This experiment used mitochondrial COI sequences to analyze the genetic composition of co-mmon wheat aphids species in Wuhan， investigated the feasibility of COI gene sequence as molecular identification for common wheat aphid species， and provided reference for effective identification and integrated management of wheat aphids in the field. 【Method】Samples of three different wheat aphids species[Rhopalosiphum padi（Linnaeus）， Macrosiphum avenae（Fabricius） and Schizaphis graminum] in the field in Wuhan and cultivated in the laboratory were collec-ted. The COI gene were amplified and sequenced. Genetic distance and the clustering were also analyzed. 【Result】In the nucleotide of COI gene fragment of the three wheat aphids，the total content of base C and base G was lower than the total content of base A and base T. The content of base G was the lowest and showed obvious base bias. All intraspecific genetic distances of these aphid species were lower than 0.010， and interspecific genetic distance was ten times more than intraspecific genetic distance of these aphid species. The analysis of clustering showed that all species of Aphidinae were clustered one clade， and then it formed three small clades which were individually clustered by different wheat aphids. 【Conclusion】The molecular identification of these wheat aphids in the field is consistent with the morphological classification. The results suggests that COI gene sequence can identify effectively the common wheat aphids in Wuhan.

Key words： wheat aphid; COI gene sequence; species identification; Aphidinae

0 引言

【研究意義】農(nóng)業(yè)害蟲所產(chǎn)生的直接和間接破壞對人類維持作物生產(chǎn)力和營養(yǎng)安全等產(chǎn)生了重要影響。麥蚜是世界各小麥產(chǎn)區(qū)的常發(fā)性害蟲，隸屬于同翅目（Homoptera）蚜科（Aphidinae），為多型性昆蟲。麥蚜主要寄生在小麥穗部和中上部葉片上刺吸為害，直接造成麥類作物大量減產(chǎn)（李宏德，2016）。麥蚜還可傳播麥類病毒（劉艷莉等，2018），間接造成糧食作物嚴(yán)重減產(chǎn)。另外，一些麥蚜已成為入侵物種，對國際糧食生產(chǎn)和貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重危害（Bass et al.，2014）。麥蚜在我國已連續(xù)多年嚴(yán)重發(fā)生，對我國小麥的安全生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅（李素娟等，2001）。在我國，危害麥類作物的蚜蟲主要有4種（韓松等，2018），在長江中下游地區(qū)危害小麥的主要蚜蟲是麥長管蚜[Sitobion avenae（Fabricius）]和禾谷縊管蚜[Rhopalosiphum padi（Linnaeus）]（杜新慧，2014）。長期以來，麥蚜的防治仍以化學(xué)防治為主，田間的不合理用藥導(dǎo)致麥蚜危害加劇及麥蚜抗藥性水平顯著上升（王曉軍等，2004;李宏德，2016）。由于蚜蟲屬典型的r-對策昆蟲，其生活周期短，營孤雌生殖，具有不同的寄主類型和顏色多型現(xiàn)象（張廣學(xué)，1999;Shufran et al.，2000），因而對各種生態(tài)系統(tǒng)具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)能力;另外，不同麥蚜對作物的取食部位和傳毒能力不同，對作物產(chǎn)生的危害程度也不同，對麥蚜的錯(cuò)誤識別將影響田間病蟲害的有效管理和風(fēng)險(xiǎn)評估。因此，快速、準(zhǔn)確地識別不同蚜種，對保障小麥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Enders等（2018）研究了土地覆蓋、溫度和降水等生態(tài)因子對麥蚜豐度及傳播病毒能力的影響，結(jié)果表明其他生態(tài)因子可能影響了禾谷縊管蚜和麥長管蚜的豐度和傳毒能力;麥二叉蚜（Schizaphis graminum）的豐度受秋季降水和冬季溫度的影響，而傳毒能力不受這些因素的影響，麥二叉蚜是麥田中病毒傳播能力最強(qiáng)的麥蚜。DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是近年來對昆蟲進(jìn)行物種鑒定的新方法。Hebert等（2003a）首次采用COI基因序列對不同物種進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該基因能進(jìn)行有效的物種識別。近幾年有關(guān)其他昆蟲的研究也表明，COI基因片段作為條形碼可進(jìn)行有效識別和物種鑒定。如為確定入境口岸攔截的變?nèi)~木上纓翅目薊馬科的Leucothrips是否對美國農(nóng)業(yè)構(gòu)成入侵威脅，Skarlinsky等（2017）采集美國不同地點(diǎn)和不同宿主的薊馬科Leucothrips成蟲和幼蟲進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)采集到的成蟲間無形態(tài)差異，形態(tài)學(xué)分析鑒定為薊馬科昆蟲L. furcatus，但采集的幼蟲形態(tài)差異明顯，經(jīng)線粒體COI基因和rRNA驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該樣本分成2組，第一組僅由幼蟲構(gòu)成，與第二組存在明顯遺傳差異，第二組樣本由幼蟲和成蟲組成，遺傳分化較低且形態(tài)高度相似，表明它們構(gòu)成單一物種，而兩組幼蟲在形態(tài)上的不同和遺傳上的差異，表明其可能存在另一種隱蔽物種。Syromyatnikov等（2017）發(fā)現(xiàn)形態(tài)鑒定不易區(qū)分扁盾蝽屬物種，因此采用COI基因序列對4種扁盾蝽屬有害物種進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該序列能準(zhǔn)確鑒定麥扁盾蝽（Eurygaster integriceps），并開發(fā)了能快速鑒定麥扁盾蝽的PCR-RFLP方法。Mackenzie等（2018）采用COI基因序列檢測田間常見蚜種中具有抑制馬鈴薯Y病毒（PVY）傳播殺蟲劑的特定抗性突變基因的頻率，結(jié)果表明，在田間采集的45種蚜蟲中至少有17種蚜種被認(rèn)為是PVY的載體，其中，桃蚜是所有檢測蚜種中對殺蟲劑抗性突變頻率最高的物種，是PVY和馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）中最有效的載體物種?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】湖北省是我國南方小麥主產(chǎn)省份，在全國小麥生產(chǎn)中占有重要地位。近年來，由于化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用，致使麥蚜抗性水平不斷增強(qiáng)。因此，如何通過現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)化學(xué)防治相結(jié)合，對田間麥蚜物種進(jìn)行有效鑒定及合理利用化學(xué)農(nóng)藥和田間綜合治理具有重要的實(shí)踐意義。目前，基于COI基因序列對田間常見麥蚜蚜種進(jìn)行分析鑒定的研究報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對湖北省武漢地區(qū)常見麥蚜種類的COI基因序列片段進(jìn)行擴(kuò)增及測序，分析不同麥蚜的遺傳特征，探討COI基因序列作為田間常見麥蚜蚜種分子鑒定標(biāo)記的可行性，為田間麥蚜的有效識別和綜合治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試禾谷縊管蚜（RP）和麥長管蚜（SA）樣品于2017年5月采自湖北省武漢市周邊麥田內(nèi);麥二叉蚜（SG）為2017年9月采自田間，之后室內(nèi)采用瑞華HP300G型智能光照培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。所有樣本于-20 ℃保存?zhèn)溆?。此外，為進(jìn)行相關(guān)物種間的比較分析，從NCBI下載3種麥蚜的16條COI基因序列及取食小麥的其他3種害蟲的COI基因序列進(jìn)行分析，序列信息見表1。

1. 2 樣本DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

參照薩姆布魯克和拉塞爾（2002）、楊子祥等（2006）的方法，采用酚—氯仿法提取基因組DNA。利用Foottit等（2008）的引物L(fēng)epF：5'-ATTCAACCA ATCATAAAGATATTGG-3'/LepR：5'-TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA-3'（由北京六合華大基因科技股份有限公司合成）擴(kuò)增COI基因。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 50 s，45～50 ℃每升1 ℃循環(huán)5次，50 ℃循環(huán)10次，退火1 min，72 ℃ 1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢艾康健生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

對所得COI基因序列采用ClustalX ver.1.83進(jìn)行多重比對（Thompson et al.，1997），包括NCBI下載3種麥蚜的16條COI基因序列及3條取食小麥的其他害蟲（麥紅吸漿蟲、大青葉蟬和小麥皮薊馬）的COI基因序列（表1），識別COI基因序列后進(jìn)行不同物種間序列比對分析。利用MEGA 7.0分析3種麥蚜COI基因的序列特征、堿基組成及序列變異情況（Kumar et al.，2016），計(jì)算所有序列間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbour-joining）構(gòu)建不同麥蚜蚜種間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，替代模型為Kimura雙參數(shù)法（Kimura-2-parameter），聚類樹分支的置信度選擇重復(fù)1000次自引導(dǎo)法（Bootstrap analysis）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 麥蚜COI基因片段的核苷酸組成

對麥蚜的線粒體COI基因序列進(jìn)行多重比對，得到長度為669 bp的COI基因片段，該片段中未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失。測序分析結(jié)果表明，在所有位點(diǎn)中，保守位點(diǎn)有589個(gè)（88%）、變異位點(diǎn)80個(gè)（12%）。3種麥蚜的堿基平均含量分別為T=40.9%、C=13.9%、A=34.5%和G=10.7%。堿基A+T含量為75.4%，其中第3位點(diǎn)A+T含量為94.1%。堿基C和G的總含量低于堿基A和T的總含量，其中含量最低的堿基為G，但不同麥蚜蚜種間的堿基組成無顯著差異（P>0.05）。堿基替換分析結(jié)果表明，有615個(gè)一致位，29個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了堿基轉(zhuǎn)換，25個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換，轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在T～C之間，顛換主要發(fā)生在T～A之間，堿基變異均勻地分布于該序列的各區(qū)域。

2. 2 不同麥蚜COI基因序列的遺傳結(jié)構(gòu)

對不同麥蚜COI基因序列間的遺傳距離進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，3種麥蚜COI基因序列間的群體內(nèi)遺傳距離較低，均低于0.010，而所有麥蚜COI基因序列間的平均遺傳距離為0.084。種間遺傳距離約是種內(nèi)遺傳距離的10倍，種間遺傳距離差異顯著（P<0.05），而種內(nèi)差異較小。

2. 3 不同麥蚜COI基因序列的聚類分析結(jié)果

基于COI基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1）顯示，蚜科的3個(gè)種聚成一支，其他的麥類害蟲各聚成不同的分支;蚜科物種聚成獨(dú)立的一支后，又形成3個(gè)獨(dú)立分支，分屬于蚜科的3種麥蚜，即麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜。3種麥蚜的不同個(gè)體各自聚類形成相對獨(dú)立的分支，且節(jié)點(diǎn)支持率較高。

3 討論

對于小型昆蟲蚜蟲物種而言，其在不同季節(jié)、不同地點(diǎn)和宿主均存在多種生物型、顏色變種和隱存種的可能（Rebijith et al.，2013）。Duan等（2017）研究了禾谷縊管蚜種群生命周期與遺傳多態(tài)性的關(guān)系，結(jié)果表明，具有相同生殖方式的禾谷縊管蚜種群表現(xiàn)出相似的遺傳結(jié)構(gòu)，而生殖方式不同的群體間遺傳差異顯著。這些差異將增加形態(tài)學(xué)鑒定的難度，且消耗大量的鑒定時(shí)間和精力。DNA條形碼技術(shù)為小型昆蟲的快速鑒定提供了可能。已有研究表明，COI基因序列作為條形碼可有效識別和鑒定不同的昆蟲物種（Hebert et al.，2003a;Syromyatnikov et al.，2017），同時(shí)可檢查不同地理種群的差異。Xu等（2011）擴(kuò)增了17個(gè)地區(qū)麥長管蚜種群的線粒體COI基因序列，結(jié)果顯示，我國北方麥長管蚜種群的遺傳多樣性高于華南種群，季節(jié)對寄主植物的影響可能增強(qiáng)了北方種群的遺傳多態(tài)性水平。

COI基因?yàn)榫€粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)編碼基因。在本研究中，3種麥蚜的COI基因序列與其他昆蟲線粒體DNA序列組成具有相似的特點(diǎn)，COI基因序列中的堿基組成表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性（Jermiin and Crozier，1994），序列中未發(fā)現(xiàn)堿基缺失或插入現(xiàn)象，可能與COI基因?yàn)榫€粒體蛋白質(zhì)編碼基因滿足功能上的需要和三聯(lián)體密碼子結(jié)構(gòu)的限制有關(guān)（Hebert et al.，2003b）。在蚜科中，已采用COI基因序列片段作為DNA條形碼對取食不同寄主植物的蚜蟲進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的鑒定。汪珍春等（2013）研究表明，采用DNA條形碼快速鑒定常見花卉蚜種具有可行性。溫娟等（2013）基于COI基因序列對北京薔薇科植物上的9屬12種蚜蟲進(jìn)行DNA條形碼分析，結(jié)果顯示北京薔薇科花卉蚜種有83%能通過DNA條形碼進(jìn)行有效區(qū)分。Coeur d'acier等（2014）為274種歐洲蚜種構(gòu)建了DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，其可對歐洲蚜種進(jìn)行無偏差分類，簡化了80%用于物種鑒定的消耗。Lee等（2015）采用COI基因序列對寄生于同種沙棘植物上形態(tài)相似的3種蚜種進(jìn)行有效區(qū)分，并鑒定出一個(gè)隱種。

種間和種內(nèi)遺傳距離間的差異程度是COI基因序列作為DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定的關(guān)鍵（Aliabadian et al.，2009），在DNA條形碼研究中物種劃分的參考值為0.02（腔腸動(dòng)物門除外）（Hebert et al.，2003b）。本研究中武漢市常見麥蚜物種內(nèi)COI基因的遺傳距離差異均低于0.010，且與種間遺傳距離的差距在10倍左右，表明該基因序列適用于麥蚜蚜種間的鑒定（Hebert et al.，2003a，2004;Meyer and Paulay，2005）。Shufran和Puterka（2011）采用基于COI基因條形碼檢驗(yàn)了美國谷物作物上的蚜蟲，發(fā)現(xiàn)該序列可成功鑒定8種全周期型蚜蟲和2種常見谷物蚜蟲。本研究以COI基因序列構(gòu)建麥蚜系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行樹，結(jié)果顯示，蚜科聚成獨(dú)立的一支，之后又形成3個(gè)分支，分屬于蚜科的3種麥蚜，麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜個(gè)體各自聚類形成相對獨(dú)立的分支，其他物種也各自聚成獨(dú)立的分支，物種間界限明晰，分支節(jié)點(diǎn)支持率較高，說明麥蚜的COI基因序列分子鑒定與常規(guī)分類結(jié)果一致，表明該基因?qū)ξ錆h市常見麥蚜物種的鑒定可行。因此，可通過COI基因鑒定技術(shù)與傳統(tǒng)分類結(jié)合的方法，對田間麥蚜物種和其他麥類害蟲進(jìn)行有效鑒定。

4 結(jié)論

3種麥蚜的分子鑒定與應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法分類的結(jié)果一致，表明采用COI基因序列可對武漢地區(qū)常見麥蚜進(jìn)行有效鑒定。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）