常曉麗 石麗敏 謝俊霞

[摘要]?目的?探討1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）對小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元興奮性的影響。

方法選用出生15～20 d的C57BL/6小鼠制備腦片，運(yùn)用腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察MPP+對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電及誘發(fā)放電的影響。

結(jié)果當(dāng)小鼠黑質(zhì)腦片灌流10 μmol/L MPP+5 min后，多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯升高（t=3.443，P<0.05）;灌流15 min左右，多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率顯著減慢（t=4.172，P<0.01）;延長灌流時間至25 min左右時，多巴胺能神經(jīng)元的放電活動可被完全抑制。在灌流MPP+5 min后，多巴胺能神經(jīng)元誘發(fā)放電頻率明顯升高（t=4.472，P<0.05），峰電位間隔時間明顯縮短（t=48.390，P<0.01）。

結(jié)論MPP+能夠以時間依賴性的方式抑制正常小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性。

[關(guān)鍵詞]?1-甲基-4-苯基吡啶;多巴胺能神經(jīng)元;膜片鉗術(shù);小鼠

[中圖分類號]?R338.8

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）01-0010-04

EFFECT OF 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM ON THE EXCITABILITY OF DOPAMINERGIC NEURONS IN THE SUBSTANTIA NIGRA IN MICE

CHANG Xiaoli， SHI Limin， XIE Junxia

（Department of Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+） on the excitability of dopami-nergic neurons in the substantia nigra in mice.

MethodsBrain slices were prepared with C57BL/6 mice aged 15-20 days， and the whole-cell patch clamp technique was used to observe the effect of MPP+ on spontaneous discharge and evoked discharge of dopaminergic neurons in the substantia nigra.

ResultsAfter the brain slices of the substantia nigra in mice were perfused with 10 μmol/L MPP+ for 5 min， there was a increase in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons， the diffe-rence is statistically significant （t=3.443，P<0.05）; after perfusion for 15 min， there was a reduction in the frequency of spontaneous discharge of dopaminergic neurons ， the difference is statistically significant ?（t=4.172，P<0.01）; after perfusion for 25 min，the discharge of dopaminergic neurons was completely inhibited. After perfusion with MPP+ for 5 min， there was a significant increase in the frequency of evoked discharge of dopaminergic neurons （t=4.472，P<0.05） and a significant reduction in interspike interval （t=48.390，P<0.01）.

ConclusionMPP+ can inhibit the excitability of dopaminergic neurons in the substantia nigra in normal mice in a time-dependent manner.

[KEY WORDS]1-methyl-4-phenylpyridinium; dopaminergic neurons; patch-clamp technique; mice

LANGSTON等[1]于1982年發(fā)現(xiàn)，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）在人類能夠?qū)е骂愃婆两鹕〉陌Y狀，如運(yùn)動遲緩、肌僵直、姿勢不穩(wěn)和靜止性震顫等[2-4]。之后又有實驗室在靈長類、嚙齒類動物相繼發(fā)現(xiàn)MPTP同樣可誘導(dǎo)帕金森病的發(fā)生[5]。研究表明，MPTP可選擇性地?fù)p傷黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，已經(jīng)成為誘導(dǎo)帕金森病動物模型最常用的藥物[6-7]。目前，對MPTP誘導(dǎo)產(chǎn)生帕金森病的作用機(jī)制研究主要集中在其對線粒體損傷上，認(rèn)為MPTP是一種親脂性的神經(jīng)毒素，很容易透過血-腦脊液屏障，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)經(jīng)單胺氧化酶B作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x產(chǎn)物1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+），然后釋放到細(xì)胞間隙被多巴胺能神經(jīng)元上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體選擇性地重攝取[8-10]，MPP+在線粒體中積聚，抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ，導(dǎo)致ATP不足、線粒體膜電位缺失、活性氧形成以及氧化應(yīng)激等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11-13]。之后又有文獻(xiàn)報道，MPTP可通過激活自噬溶酶體途徑損傷多巴胺能神經(jīng)元[14-15]。然而，MPTP對多巴胺能神經(jīng)元電活動的影響尚不清楚。鑒于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元有自發(fā)放電行為[16-17]，且放電活動的變化與多巴胺遞質(zhì)的釋放量密切相關(guān)[18-21]，因此，闡明MPTP/MPP+對神經(jīng)元電活動的影響至關(guān)重要。本研究旨在探討急性灌流MPP+對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電和誘發(fā)放電的影響。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1實驗動物?出生15～20 d的C57BL/6小鼠由蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供。動物的飼養(yǎng)和手術(shù)符合青島大學(xué)動物倫理學(xué)要求。

1.1.2主要試劑?MPP+由美國Sigma公司提供，用三蒸水稀釋至100 mmol/L溶液，在應(yīng)用前稀釋至10 mmol/L，-20 ℃保存。

1.1.3溶液配制?①人工腦脊液（ACSF）配制：將3.0 mmol/L KCl、124.0 mmol/L NaCl、1.3 mmol/L Na2HPO4、1.3 mmol/L CaCl2、26.0 mmol/L NaHCO3、2.4 mmol/L MgCl2和10.0 mmol/L Glucose混合，調(diào)整pH值至7.4（用1 mol/L NaOH稀釋），滲透壓770 kPa（用滲透壓測量儀進(jìn)行測量），并持續(xù)通入含體積分?jǐn)?shù)0.95 O2和體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的混合氣體進(jìn)行氧合。②低鈣切片液配制：將3.0 mmol/L KCl、124.0 mmol/L NaCl、1.3 mmol/L Na2HPO4、2.0 mmol/L CaCl2、26.0 mmol/L NaHCO3、1.0 mmol/L MgCl2和10.0 mmol/L Glucose混合，使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，滲透壓為770 kPa（用滲透壓測量儀檢測），并持續(xù)通入含體積分?jǐn)?shù)0.95 O2和體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的混合氣體進(jìn)行氧合。③電極內(nèi)液的配制：將10.0 mmol/L HEPES、120.0 mmol/L K-gluconate、20.0 mmol/L KCl、2.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/L EGTA、2.0 mmol/L Na2ATP以及0.3 mmol/L的Na2GTP混合，用1 mmol/L KOH調(diào)節(jié)pH值至7.3，以500 μL分裝后-20 ℃儲存。

1.2?實驗方法

1.2.1離體黑質(zhì)腦片制備?制備方法參見文獻(xiàn)[22]。

1.2.2腦片全細(xì)胞膜片鉗電生理記錄?將離體腦片轉(zhuǎn)移至持續(xù)灌流ACSF的浴槽內(nèi)，ASCF持續(xù)通入含體積分?jǐn)?shù)0.95 O2及體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的混合氣體，并選擇狀態(tài)良好、邊界清晰的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。將拋光的玻璃微電極（其電阻為5～10 MΩ）注入電極內(nèi)液并使電極尖端進(jìn)入液面以下。當(dāng)電極尖端接近細(xì)胞表面并在細(xì)胞表面壓出類似“酒窩”的形狀時（此時電流變小，電阻慢慢變大），迅速釋放正壓，使細(xì)胞膜快速達(dá)到千兆封接。如果電阻沒有達(dá)到千兆，則通過注射器給予細(xì)胞膜片一個負(fù)壓，使之達(dá)到千兆封接，并補(bǔ)償快電容。之后，采用負(fù)壓法吸破電極與細(xì)胞相接觸的膜片，使電極與細(xì)胞內(nèi)液相通，并補(bǔ)償慢電容。轉(zhuǎn)換至電流鉗模式，將電流鉗置于0 pA，完成全細(xì)胞電流鉗記錄，判斷是否為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元[19]。數(shù)據(jù)用Patchmaster軟件采集并儲存，用Minianalysis、Clamfit等軟件進(jìn)行分析。

1.3?統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗所得數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，同一個神經(jīng)元灌流藥物前后放電頻率以及峰電位間隔時間的比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2?結(jié)??果

2.1?MPP+對多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電活動影響

本實驗共記錄了6個黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，其自發(fā)放電的頻率為（1.41±0.32）Hz，當(dāng)灌流含有10 μmol/L MPP+的ASCF 5 min后，多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率為（2.30±0.43）Hz，與加藥前相比較，放電頻率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.443，P<0.05）。繼續(xù)灌流該藥物，在灌流15 min左右時，多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率為（0.78±0.21）Hz，與加藥前相比較，放電頻率顯著減慢（t=4.172，P<0.01）。繼續(xù)延長灌流時間至25 min左右，多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)放電活動被完全抑制，應(yīng)用ASCF沖洗腦片，有1個多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率被完全恢復(fù)，其余的多巴胺能神經(jīng)元均未能恢復(fù)自發(fā)放電活動。

2.2?MPP+對多巴胺能神經(jīng)元誘發(fā)放電活動影響

本實驗又記錄了5個黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，并在電流鉗下給予細(xì)胞膜30 pA的電流刺激，多巴胺能神經(jīng)元誘發(fā)放電頻率為（2.15±0.20）Hz，峰電位間隔時間為（0.19±0.11）s;在灌流10 μmol/L的MPP+5 min后，多巴胺能神經(jīng)元誘發(fā)放電頻率為（3.89±0.31）Hz，峰電位間隔時間為（0.11±0.13）s。與灌流藥物前相比，多巴胺能神經(jīng)元誘發(fā)放電頻率顯著增加（t=4.472，P<0.05），峰電位間隔時間顯著縮短（t=48.390，P<0.01）。

3?討??論

黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的電活動在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)以及帕金森病中發(fā)揮重要作用，其放電頻率增加或放電模式向簇狀放電的轉(zhuǎn)換均促進(jìn)多巴胺的釋放，但興奮性過度增高可引起多巴胺能神經(jīng)元的死亡。而放電頻率降低1 Hz即可導(dǎo)致多巴胺的釋放下降10%，影響機(jī)體的運(yùn)動功能[23-24]。因此，闡明神經(jīng)毒素或其他致病因素對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元放電活動的影響，對于研究帕金森病的病理機(jī)制及治療措施是極其關(guān)鍵的。

本研究選用低濃度（10 μmol/L）的MPP+急性灌流黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，結(jié)果表明，MPP+對多巴胺能神經(jīng)元電活動的抑制作用具有時間依賴性。在開始灌流的5 min左右，多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率是明顯增加的，但隨著灌流時間的延長，多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率開始顯著減慢甚至被完全抑制。MASI等[25]的研究結(jié)果顯示，使用50 μmol/L的MPP+灌流黑質(zhì)腦片時，多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率可在5 min左右受到明顯抑制，并沒有出現(xiàn)短時間的多巴胺能神經(jīng)元放電頻率增加。目前的研究認(rèn)為，MPP+主要通過在線粒體聚集，抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ，引起ATP不足，激活鉀離子通道、HCN通道等多種離子通道，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元放電活動減慢[25-26]。我們推測，當(dāng)?shù)蜐舛鹊腗PP+短時間作用于多巴胺能神經(jīng)元時，多巴胺能神經(jīng)元處于應(yīng)激狀態(tài)，通過提高自身興奮性釋放較多的多巴胺遞質(zhì)來進(jìn)行自身保護(hù)。隨著灌流時間延長，更多MPP+進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元并在線粒體中聚集，對線粒體的損傷作用增強(qiáng)，超出多巴胺能神經(jīng)元的代償能力，因此，隨著灌流MPP+時間的延長，多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率被逐漸抑制。高濃度的MPP+可快速進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元，對線粒體的損傷作用強(qiáng)，在很短的時間內(nèi)就可以明顯抑制多巴胺能神經(jīng)元的放電活動。在灌流MPP+5 min時，多巴胺能神經(jīng)元的誘發(fā)放電頻率顯著增加，峰電位間隔時間顯著縮短，進(jìn)一步支持低濃度的MPP+可在短時間內(nèi)增強(qiáng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性。

之前的研究表明，神經(jīng)毒素MPTP/MPP+抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ，引起活性氧的增多和細(xì)胞凋亡，許多肽類或激動劑可通過抗凋亡抗氧化途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[27-29]。通過研究MPTP對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元電活動的調(diào)控，進(jìn)一步完善了其對多巴胺能神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制，為帕金森病的治療提供了新的方向。

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