張付民　冉仁國(guó)　趙賓賓

〔摘要〕 目的 觀察酸棗仁湯對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠視交叉上核（uprachiasmatic nucleus， SCN）生物鐘基因Clock和Bmal1蛋白表達(dá)的影響。方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組，除空白組外，其他各組用多平臺(tái)水環(huán)境法制定慢性睡眠剝奪模型并予以相應(yīng)干預(yù)。采用自主活動(dòng)測(cè)試儀記錄大鼠自主活動(dòng)時(shí)間，免疫組化和Western blot檢測(cè)SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠自主活動(dòng)時(shí)間TL（光照時(shí)段4個(gè)點(diǎn)之和）、TD（黑暗時(shí)段4個(gè)點(diǎn)之和）、TALL（光照+黑暗8個(gè)時(shí)段之和）明顯增加（P<0.01）;SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)水平下降（P<0.01）。干預(yù)后，與模型組比較，舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組大鼠TL、TD、TALL均減少（P<0.01或P<0.05）。舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)上升（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 酸棗仁湯能改善慢性睡眠剝奪大鼠的睡眠狀態(tài)，其機(jī)制可能與酸棗仁湯調(diào)節(jié)大鼠SCN中Clock和Bmal1的表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 視交叉上核;酸棗仁湯;睡眠剝奪;生物鐘基因;Clock;Bmal1;自主活動(dòng)時(shí)間

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.01.005

Effect of Suanzaoren Decoction on Expression of Circadian Genes Clock and Bmal1 in the Suprachiasmatic Nucleus in Chronically Sleep-Deprived Rats

ZHANG Fumin1， RAN Renguo1*， ZHAO Binbin2

（1. Enshi Central Hospital of Hubei Province， Enshi， Hubei 445000; 2. School of Basic Medical Sciences，

Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Suanzaoren Decoction on the protein expression of circadian genes Clock and Bmal1 in the suprachiasmatic nucleus （SCN） in chronically sleep-deprived rats. Methods The experimental rats were randomly divided into blank group， model group， Eurodin group， and Suanzaoren Decoction group. All rats except those in the blank group were subjected to a multi-platform water bath to establish a model of chronic sleep deprivation， and each group received the corresponding treatment. An autonomic activity recorder was used to record the time of autonomic activities of the rats. Immunohistochemistry and Western blot were used to measure the protein expression of Clock and Bmal1 in the SCN. Results Compared with the blank group， the model group showed significantly increased TL （sum of automatic activity time recorded at four time points in the light）， TD （sum of automatic activity time recorded at four time points in the dark）， and TALL（sum of automatic activity time recorded at eight time points in the light and dark） （P<0.01）， and significantly decreased protein expression levels of Clock and Bmal1 in the SCN （P<0.01）. Compared with the model group， the Eurodin group and Suanzaoren Decoction group showed significantly decreased TL， TD， and TALL after administration （P<0.01 or P<0.05）， and significantly increased protein expression levels of Clock and Bmal1 in the SCN （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Suanzaoren Decoction can improve the sleep state of chronically sleep-deprived rats， which may be related to its regulation of the expression of Clock and Bmal1 in the SCN of rats.

〔Keywords〕 suprachiasmatic nucleus; Suanzaoren Decoction; sleep deprivation; circadian gene; Clock; Bmal1; time of autonomic activity

失眠是以入睡難、易醒、睡眠欠深度為主要癥狀的臨床常見(jiàn)病癥[1]，嚴(yán)重困擾著患者的生活和工作，已成為一種新的流行病[2]。據(jù)中國(guó)睡眠研究會(huì)2016年公布的睡眠調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)成年人失眠發(fā)生率高達(dá)38.2%，明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家，超過(guò)3億中國(guó)人有睡眠障礙[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)[4]，失眠與生物鐘調(diào)節(jié)基因失調(diào)有關(guān)。視交叉上核（suprachiasmatic nucleus， SCN）是哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)系統(tǒng)的中樞結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)身體內(nèi)各種晝夜節(jié)律活動(dòng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，SCN中Clock和Bmal1的表達(dá)失調(diào)與失眠癥密切相關(guān)[6]。酸棗仁湯是臨床治療慢性失眠的常用方，能顯著改善患者的睡眠質(zhì)量，但其作用機(jī)制尚未完全明確。為進(jìn)一步探明酸棗仁湯改善睡眠的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬采用多平臺(tái)水環(huán)境睡眠剝奪法建立慢性睡眠剝奪大鼠模型，用免疫組化和Western blot檢測(cè)SCN中Clock和Bmal1蛋白的表達(dá)，以期為酸棗仁湯治療失眠提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

成年健康SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量為200～250 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。

1.2? 主要藥品及試劑

酸棗仁湯由湖北省恩施州中心醫(yī)院中藥房提供，酸棗仁湯按方劑學(xué)[7]計(jì)量配伍，即酸棗仁30 g，知母9 g，茯苓6 g，川芎6 g，甘草3 g。煎煮前用純水將藥物浸泡20 min，浸泡好后，先后用武火和文火煎煮20 min，濾出藥液，再次加水煮開(kāi)，濾出藥液，混勻2次煎取的藥液，用旋蒸儀濃縮藥液至每毫升藥液含生藥0.486 g。舒樂(lè)安定，北京益民藥業(yè)有限公司，批號(hào)H20170625。Clock一抗兔抗鼠抗體，美國(guó)Chemi-Con公司，批號(hào)：H77260。Bmal1一抗兔抗鼠抗體，美國(guó)Chemi-Con公司，批號(hào)：H47110。二抗羊抗兔抗體，武漢科瑞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20170315。Dako LSAB2通用性免疫組化試劑盒，丹麥Dako公司，批號(hào)SU187565。DAB濃縮型顯色試劑盒，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司，批號(hào)KS214968。

1.3? 主要儀器

參考文獻(xiàn)[8]自制睡眠剝奪箱，箱體大小為72 cm×48 cm×50 cm，箱內(nèi)置6個(gè)連體直徑為8 cm，高為8 cm的圓形平臺(tái)，呈2×3排列。ZZ-6型自主活動(dòng)測(cè)試儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）、Universal Hood Ⅲ型凝膠圖像成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1? 動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組，每組10只，除空白組外，其他各組用多平臺(tái)水環(huán)境法以制定慢性睡眠剝奪模型[9]。

2.2? 慢性睡眠剝奪模型的建立及干預(yù)

將模型組、舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組3組大鼠放在多平臺(tái)水環(huán)境中進(jìn)行睡眠剝奪，于15時(shí)到次日8時(shí)連續(xù)18 h睡眠剝奪，連續(xù)剝奪21 d。大鼠入睡或肌肉松弛時(shí)就會(huì)掉入水中，以此達(dá)到睡眠剝奪的目的。

造模完成后，根據(jù)“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值”計(jì)算動(dòng)物給藥劑量，舒樂(lè)安定組大鼠按0.18 mg/（kg·d）給藥，酸棗仁湯組按4.86 g/（kg·d）給藥，給藥容量均為1 mL/100 g，定于每天中午12時(shí)給藥，連續(xù)灌胃2周，1次/d?？瞻捉M和模型組給予等體積的生理鹽水，療程同酸棗仁湯組。

2.3? 動(dòng)物取材及處理

自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)完成后取材，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉好后斷頭取腦，冰上分離大鼠下丘腦，鏡下再分離SCN腦組織，置液氮速凍，24 h內(nèi)移于-80 ℃冰箱保存。

2.4? 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1? 自主活動(dòng)時(shí)間檢測(cè)? 末次灌胃結(jié)束后12 h，應(yīng)用自主活動(dòng)測(cè)試儀觀察大鼠自主活動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)前將自主活動(dòng)測(cè)試儀設(shè)置為12D/12L光暗循環(huán)，即8：00-20：00為光照時(shí)間，21：00-7：00為黑暗時(shí)間。分別于0：00、3：00、6：00、9：00、12：00、15：00、18：00和21：00觀察大鼠自主活動(dòng)時(shí)間，每次觀察3 min。用TALL表示大鼠8個(gè)時(shí)點(diǎn)自主活動(dòng)時(shí)間之和，TL表示光照時(shí)段4個(gè)時(shí)點(diǎn)自主活動(dòng)時(shí)間之和，TD表示黑暗時(shí)段4個(gè)時(shí)點(diǎn)自主活動(dòng)時(shí)間之和。分析和比較4組TALL、TL和TD。

2.4.2? 免疫組化檢測(cè)SCN中Clock、Bmal1蛋白表達(dá)水平? 自主活動(dòng)時(shí)間檢測(cè)完畢后取材，用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉（4 mL/kg），麻醉好后用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定48 h。固定好后，石蠟包埋切片和脫水，用3%H2O2浸泡15 min，PBS沖洗3次，每次3 min;分別加入一抗Clock和一抗Bmal1（Clock稀釋度為1∶400，Bmal1稀釋度為1：200），37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次，每次3 min;加入二抗（稀釋度為1∶3 000），37 ℃孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min;DAB顯色5 min，依次水洗、復(fù)染、脫水、透明、封片和觀察。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍（×400）視野，用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像處理。獲取累積光密度（IOD），進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4.3? Western blot檢測(cè)SCN中Clock、Bmal1蛋白表達(dá)水平? 用Western blot檢測(cè)4組大鼠SCN中Clock和Bmal1的蛋白表達(dá)量，內(nèi)參為β-actin。取SCN腦組織20 mg，加蛋白裂解液，冰上研磨，以4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清，用BCA蛋白質(zhì)試劑盒分別測(cè)定4組蛋白量;依次加樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和室溫封閉;按抗體說(shuō)明書加入一抗Clock和一抗Bmal1（Clock稀釋度為1∶400，Bmal1稀釋度為1∶200），置4 ℃冰箱過(guò)夜，洗膜，再加入二抗（稀釋度為1∶3 000），ECL顯色;置于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光各組蛋白條帶，拍照，分析灰度值。

2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 自主活動(dòng)時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

從表1和圖1可以看出，與空白組比較，模型組大鼠TL、TD、TALL明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組大鼠TL、TD、TALL均有減少（P<0.01，P<0.05）。

3.2? 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖2、圖3和表2可以看出，空白組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)水平較高;造模后，模型組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)水平相比，模型組下降（P<0.01）;給藥后，舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組大鼠相比，模型組SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)均上升（P<0.01，P<0.05）。

3.3? Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖4和表3可以看出，空白組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)水平較高;造模后，模型組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)水平下降（P<0.01）;給藥后，舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組大鼠相比模型組SCN中Clock和Bmal1蛋白表達(dá)均上升（P<0.01，P<0.05）。

4 討論

酸棗仁湯出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》[10]，由酸棗仁、川芎、茯苓、知母和炙甘草組成，主治“虛勞虛煩不得眠”，方中酸棗仁養(yǎng)血補(bǔ)肝、寧心安神，為君藥;茯苓寧心安神，知母滋陰清熱，二者共為臣藥;川芎調(diào)暢肝氣，為佐藥;炙甘草調(diào)和諸藥，為使藥，全方共奏養(yǎng)血滋陰、除煩安神之功。失眠患者常有煩躁不安的行為表現(xiàn)，尤其是夜晚入睡時(shí)[11]。這種“煩躁不安”在睡眠剝奪動(dòng)物模型身上就表現(xiàn)為晝夜活動(dòng)節(jié)律失調(diào)[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)睡眠剝奪，模型組大鼠活動(dòng)時(shí)間明顯增加（P<0.01），與正常組比較，模型組大鼠晝夜活動(dòng)節(jié)律失調(diào)明顯失調(diào)，而給與酸棗仁湯后，睡眠剝奪模型大鼠自主活動(dòng)時(shí)間明顯減少（P<0.01，P<0.05），晝夜活動(dòng)節(jié)律失調(diào)明顯好轉(zhuǎn)，這說(shuō)明酸棗仁湯可以改善睡眠剝奪模型大鼠的睡眠狀態(tài)。

SCN是哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)系統(tǒng)的中樞結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)身體內(nèi)各種晝夜節(jié)律活動(dòng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，SCN中存在多種與睡眠節(jié)律相關(guān)的基因，如Per1、Per2、Clock、Bmal1等，其中已明確證實(shí)[14]Clock和Bmal1可以控制睡眠的穩(wěn)態(tài)， 二者的表達(dá)紊亂可導(dǎo)致睡眠-覺(jué)醒失調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，失眠患者SCN中Clock和Bmal1表達(dá)明顯低于正常人，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠SCN中Clock和Bmal1表達(dá)水平較高。造模后，模型組大鼠SCN中Clock和Bmal1表達(dá)水平下降。給藥后，舒樂(lè)安定組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Clock和Bmal1表達(dá)上升。

綜合分析，課題組認(rèn)為酸棗仁湯能改善慢性睡眠剝奪大鼠的睡眠狀態(tài)，其機(jī)制可能與酸棗仁湯調(diào)節(jié)大鼠SCN中Clock和Bmal1的表達(dá)有關(guān)。這為酸棗仁湯防治失眠提供了新思考和新靶點(diǎn)。

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