王繼業(yè) 姚偉宣 王鵬娟 孟凡偉

摘? 要：數(shù)字化單分子免疫分析（Simoa）技術(shù)是一種新型的超高靈敏度、特異性、全自動化的多重檢測技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了單分子、圖像識別、數(shù)字化分析和熒光檢測技術(shù)，能實現(xiàn)單分子檢測，目前已經(jīng)在神經(jīng)性疾病的微創(chuàng)檢查、腫瘤早期診斷、炎癥、感染性疾病甚至miRNA檢測等領(lǐng)域進行大量研究，均取得了不錯的成果。毒品成癮、戒斷和耐受實質(zhì)上是機體的一系列生理、生化過程，Simoa技術(shù)用于吸毒人員的生理生化研究將有助于闡明毒品成癮和耐受機制，并為毒品戒斷藥物的研制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：單分子免疫分析技術(shù);毒品成癮;生物標志物

中圖分類號：O657.3;TP212.3? ? ? 文獻標識碼：A 文章編號：2096-4706（2019）10-0016-03

Abstract：Digital single molecule immunoassay（Simoa）is a new type of ultra-sensitive，specific，fully automated multiplex detection technology. This technology combines single molecule，image recognition，digital analysis and fluorescence detection technology to achieve single molecule detection. It has been extensively used in the fields of minimally invasive neurological examination，early tumor diagnosis，inflammation，infectious diseases and even miRNA detection. The research has achieved good results. Drug addiction，withdrawal and tolerance are essentially a series of physiological and biochemical processes in the body. Simoa technology used in the physiological and biochemical research of drug addicts will help to clarify the mechanism of drug addiction and tolerance，and provide theoretical basis for the development of drug withdrawal drugs.

Keywords：single molecule immunoassay;drug addiction;biomarkers

0? 引? 言

毒品成癮是指對毒品的心理依賴和生理依賴，是一種慢性、復(fù)發(fā)性的腦部疾病，嚴重影響個人健康、家庭和睦和社會安定。對毒品成癮機制和戒斷原理的研究將有助于吸毒人員進行科學、有效的毒品戒斷。毒品進入人體后會進行一系列的生理和生化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，并改變?nèi)梭w各種生物分子的含量，這些生物分子的改變對與研究毒品成癮機制和研制毒品戒斷藥物均有重要意義，是目前神經(jīng)生物學的研究熱點。

針對毒品生物標志物的研究，涉及到的檢測方法包括色譜法、質(zhì)譜法、光譜法和免疫法等，已經(jīng)有大量文獻進行了介紹。近幾年出現(xiàn)了一種新型的超高靈敏度數(shù)字化單分子免疫分析（Simoa）技術(shù)。目前已經(jīng)在神經(jīng)、炎癥、感染、腫瘤等方面獲得了應(yīng)用，取得了客觀的成果，而在毒品檢測方面還未見其應(yīng)用。該技術(shù)超高靈敏度的生物標志物檢測性能能檢測到普通檢測方法檢測不出的物質(zhì)，這對重新認識毒品成癮帶來的生理生化變化有及其重要作用，并將極大推進成癮機制的研究進展。

本文綜述了Simoa技術(shù)目前的應(yīng)用領(lǐng)域及其優(yōu)勢，并對其在毒品成癮機制和戒斷藥物研制方面的應(yīng)用進行了展望。

1? 技術(shù)原理

Simoa技術(shù)的基本原理為大量固定捕獲抗體的磁珠與樣本進行反應(yīng)，通過控制磁珠和樣本中抗原的比例，可以使每個磁珠只結(jié)合一個或不結(jié)合抗原，而后加入熒光標記的二抗，結(jié)合了抗原的磁珠將產(chǎn)生熒光信號;將磁珠-抗原抗體復(fù)合物加到刻滿微孔的芯片上，通過控制微孔的尺寸，可以保證每個微孔只含有一個磁珠-抗原抗體復(fù)合物;而后在其表面鋪一層特制的油進行熒光成像，根據(jù)圖像上每個微孔是否發(fā)出熒光進行計數(shù)，通過熒光分子的比例可以推算出抗原的濃度，以數(shù)字化檢測方式極大提高檢測的靈敏度。該技術(shù)結(jié)合了熒光檢測、單分子和數(shù)字化分析技術(shù)，具有超高靈敏度、特異性、全自動化、支持多重檢測等性能。為了驗證該技術(shù)的靈敏度，Rissin等對比了Simoa和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在檢測前列腺癌抗原方面的效果，結(jié)果Simoa的檢測下限比酶聯(lián)免疫反應(yīng)低1000倍，達到了fg/mL[1]。

2? Simoa應(yīng)用領(lǐng)域

基于Simoa的優(yōu)良檢測性能和操作方便性，目前已經(jīng)有大量研究人員將其應(yīng)用于神經(jīng)性疾病、腫瘤、炎癥、感染性疾病及miRNA檢測等領(lǐng)域。

神經(jīng)絲蛋白L（NFL）是一種能用于神經(jīng)損傷檢測的生物標志物。傳統(tǒng)的免疫分析技術(shù)不能檢出血清中的NFL，需要抽取病人的腦脊液，從而會產(chǎn)生較大損傷。Kuhle等用三種不同的免疫分析方法檢測血液和腦脊液中的NFL，結(jié)果Simoa的檢測下限為0.62pg/mL（0個樣本低于檢測下限）;電化學免疫分析技術(shù)的檢測限為15.6pg/mL（20個樣本低于檢測下限）;酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的檢測限為78.0pg/mL（18個樣本低于檢測下限），Simoa技術(shù)的檢測下限是電化學免疫分析技術(shù)的25倍，是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的125倍。而血清中NFL的水平與腦脊液中的水平相關(guān)，因而可以用Simoa技術(shù)進行腦部疾病和神經(jīng)性疾病的微創(chuàng)檢測[2]。Disanto等以Simoa技術(shù)對多發(fā)性硬化患者和健康人群的血清中的NFL濃度進行檢測比較，結(jié)果有腦部和/或脊柱釓增強病變的患者血清NFL濃度高于健康人群，且濃度與病變數(shù)目相關(guān)，經(jīng)過不同療法治療之后，病變患者的血清NFL濃度降低。而傳統(tǒng)的分析技術(shù)不能檢測這么低的血清NFL濃度，用Simoa技術(shù)檢測血清NFL濃度可用于多發(fā)性硬化的早期診斷和治療跟蹤[3]。

用傳統(tǒng)影像和生化技術(shù)進行腫瘤診斷，發(fā)現(xiàn)的時候多為中晚期，而早發(fā)現(xiàn)早治療可以極大提高腫瘤患者的治愈率，近年來科學家們在嘗試用不同的技術(shù)提高腫瘤標志物的檢測靈敏度，從而達到早發(fā)現(xiàn)早治療的目的。Simoa技術(shù)的超高靈敏度使其在腫瘤早期診斷和術(shù)后評估中有極大的應(yīng)用前景。目前Simoa技術(shù)是唯一可以檢測到前列腺切除術(shù)后血清中PSA濃度的方法，其檢測靈敏度是傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)的1667倍，這對前列腺癌切除術(shù)后的復(fù)發(fā)風險評估和二次放療具有重要意義，既可以避免過度放療，也可以降低因介入不及時而導致的癌癥復(fù)發(fā)[4]。

感染性疾病檢測方面，Simoa技術(shù)也取得了優(yōu)異的成果。Simoa技術(shù)的p24檢測下限為4.87fg/mL，比傳統(tǒng)免疫分析方法高2000～3000倍，能比傳統(tǒng)免疫分析方法提前9～11天檢測到HIV感染，這對HIV的治療和傳染預(yù)防具有很大意義[5]。Simoa技術(shù)還能將糞便中的艱難梭菌毒素的檢測假陽性降低25%，是一種簡單、經(jīng)濟的感染篩查方法。在登革熱感染出現(xiàn)癥狀之前，目前的血清學實驗無法檢測到循環(huán)系統(tǒng)中IgG和IgM抗體，而Simoa技術(shù)能將IgG檢測靈敏度提高1000倍，IgM檢測靈敏度提高10000倍，可用來區(qū)分原發(fā)性和繼發(fā)性感染，評估發(fā)生登革出血熱（DHF）及登革休克綜合征（DSS）的風險[6]。

炎癥方面，Song等用Simoa技術(shù)監(jiān)測克羅恩病TNF- α免疫治療后細胞因子的變化。與對照相比，克羅恩病患者的血漿IL-6水平升高，但是TNF-α無顯著不同，抗TNF-α治療12周，患者的IL-6和TNF-α水平下降，而傳統(tǒng)的分析方法靈敏度不夠高，無法監(jiān)測治療后的TNF-α水平[7]。

Simoa技術(shù)不僅能進行免疫分析，通過設(shè)計還能檢測核酸。在磁珠表面偶聯(lián)捕獲核酸探針，當核酸目標物存在時，將形成捕獲核酸探針-目標物-信號核酸探針復(fù)合物;將復(fù)合物落到光盤的小孔中即可進行熒光數(shù)字化分析，得到核酸濃度。特別是用在miRNA檢測方面時，Simoa技術(shù)的超高靈敏度和特異性性能，使得檢測過程不需要進行靶向擴增。以三重血清回收率實驗，用來檢測檢測人肺總RNA中的miR-141、miR-21和miR-16靈敏度和交叉反應(yīng)，驗證了Simoa技術(shù)在miRNA檢測中具有超高靈敏度和特異性，其LOQ值接近10fM，且交叉反應(yīng)少[8]。Rissin等用堿性肽核酸探針通過互補配對特異性結(jié)合miRNA-122，能識別單個堿基的錯配，與健康人群對照相比，急性肝損傷患者血清中miRNA-122的水平較高[9]。

3? 毒品成癮研究

各類毒品進入人體后會到達腦部的不同區(qū)域，而后激活信號轉(zhuǎn)導通路產(chǎn)生毒理作用，目前研究比較多的信號通路有阿片受體、多巴胺、大麻受體、谷氨酸受體和絲裂酶原活化蛋白激酶等，可以介導神經(jīng)興奮或抑制，從而影響行為、記憶和學習能力。早在90年代就有文獻報道嗎啡能刺激機體產(chǎn)生和釋放細胞因子，其中最重要的是白細胞介素。而后在研究戒斷藥物AV411的時候發(fā)現(xiàn)，嗎啡改變了膠質(zhì)激活標志物、細胞因子、趨化因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達[10]。Mao等進行進一步研究發(fā)現(xiàn)嗎啡不僅具有很高的成癮性和耐受潛力外，還可誘導免疫抑制。對脂多糖誘導的84種炎癥相關(guān)基因表達情況監(jiān)測后發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受動物脾臟中的TNF-α和IL-β顯著降低。在毒品戒斷藥物研究方面，張曉輝及其合作研究者發(fā)現(xiàn)精神活性物質(zhì)首先激活Toll樣受體4（TLR4），從而活化小膠質(zhì)細胞，產(chǎn)生炎癥因子，正向調(diào)節(jié)信號通路，提高神經(jīng)元興奮性，以致毒品成癮和依賴;他們通過設(shè)計和篩選發(fā)現(xiàn)可用于毒癮戒斷治療的小分子抑制劑，并已經(jīng)運用于臨床試驗[11]。毒品成癮機制所涉及的生理生化過程繁多而復(fù)雜，目前已有很多的文獻對毒品的成癮機制進行了研究，涉及神經(jīng)內(nèi)分泌、細胞內(nèi)信使等系統(tǒng)，檢測的標志物包括免疫因子、炎癥因子、RNA等。

4? 結(jié)? 論

Simoa技術(shù)是一種新型的免疫分析技術(shù)，檢測原理涉及了單分子和數(shù)字化檢測技術(shù)，具有超高靈敏度、特異性、能實現(xiàn)多重自動化檢測，并且支持自主試劑研發(fā)。目前已經(jīng)在神經(jīng)性疾病微創(chuàng)檢測和生理分析、腫瘤的早期診斷和術(shù)后風險評估、感染性疾病的早期檢測和預(yù)防、炎癥因子的研究等方面得到了應(yīng)用。毒品成癮和戒斷過程中的生理生化過程復(fù)雜，到目前為止還沒有完全闡明，將Simoa技術(shù)用于吸毒和戒毒人員的生物標志物研究將有助于發(fā)現(xiàn)含量微小的標志物，進而對成癮機制研究和戒斷藥物的研制提供技術(shù)支持。

參考文獻：

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作者簡介：王繼業(yè)（1982.03-），男，漢族，山東煙臺人，副教授，博士，研究方向：毒品防控。