童文濤 陳彪 彭孟凡 趙禎 肖翎 宋增福 張慶華

摘要：【目的】優(yōu)化具群體感應(yīng)淬滅作用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）T-1株的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，進(jìn)一步提高其產(chǎn)孢量，為今后開發(fā)地衣芽孢桿菌制劑（抗菌益生菌）打下基礎(chǔ)?！痉椒ā吭趽u床發(fā)酵條件下，采用單因素試驗(yàn)篩選T-1株的最佳培養(yǎng)條件，并確定影響發(fā)酵菌液活菌含量的主要影響因素。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，篩選出影響芽孢產(chǎn)量的2個(gè)最顯著因素，以最陡爬坡試驗(yàn)確定其響應(yīng)中心點(diǎn)和最佳濃度范圍，然后通過Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件?！窘Y(jié)果】T-1株的最適發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、鹽度0.5%和pH 6.0，在此條件下T-1株芽孢產(chǎn)量與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，在培養(yǎng)48～60 h期間其芽孢產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。在對(duì)T-1株芽孢產(chǎn)量影響較大的6個(gè)因子[X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（搖床轉(zhuǎn)速）和X6（接種量）]中，X2（可溶性淀粉）對(duì)T-1株芽孢產(chǎn)量的影響達(dá)顯著水平（P<0.05），X5（搖床轉(zhuǎn)速）的影響達(dá)極顯著水平（P<0.01），其他因子的影響均不顯著（P>0.05）。T-1株的最佳培養(yǎng)基為可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%和CaCl2 0.5%，在搖床轉(zhuǎn)速218 r/min的培養(yǎng)條件下，其芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前采用初始基礎(chǔ)培養(yǎng)基的芽孢產(chǎn)量提高6.25倍?！窘Y(jié)論】具群體感應(yīng)淬滅作用地衣芽孢桿菌T-1株在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，其芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前明顯提高，且延長菌株生長的穩(wěn)定期，加上優(yōu)化篩選出的培養(yǎng)基是采用相對(duì)廉價(jià)且高效的原材料，有效節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵成本，可在規(guī)?；a(chǎn)上推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 地衣芽孢桿菌;培養(yǎng)基;發(fā)酵條件;單因素試驗(yàn);響應(yīng)面分析法

中圖分類號(hào)： S917.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）11-2559-08

Optimization of culture media and fermentation conditions of quorum sensing quenching bacteria Bacillus licheniformis T-1

TONG Wen-tao1，2， CHEN Biao1，2， PENG Meng-fan1，2， ZHAO Zhen1，2，

XIAO Ling1，2， SONG Zeng-fu1，2*， ZHANG Qing-hua1，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China; 2National Pathogen Collection for Aquatic Animals， Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306， China; 3Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources， Ministry of Education，

Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】To optimize the culture medium and fermentation conditions of Bacillus licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching effect， further increase its spore production，lay the foundation for future development of Bacillus licheniformis preparations（antibacterial probiotics）. 【Method】The optimum culture condition of T-1 bacterial strain was screened and chosen in the way of single factor method under the shaking flask fermentation condition， and the main influencing factors affecting the live bacteria content of the fermentation broth were determined. According to the results of Plackett-Burman test， the two most significant factors affecting spore yield were screened. The steepest climbing test was used to determine the response center point and the optimal concentration range of the two factors， and then the box-Behnken center combination test and response surface were used to obtain the best fermentation culture conditions. 【Result】The optimal culture temperature was 37 ℃， the optimum growth salinity was 0.5% and the optimum growth pH was 6. Under this condition， the spore formation was in positive correlation with culture time. The sporulation rate were stable between 48-60 h. Among the six factors that had great impact on the spore yield of T-1 strains[X1（molasses）， X2（soluble starch）， X3（yeast extract powder）， X4（CaCl2）， X5（shaker speed）， and X6（inoculation amount）]，the effect of X2（soluble starch） on the spore yield of T-1 strain reached a significant level（P<0.05）， the effect of X5（shaker speed） reached an extremely significant level（P<0.01）， and the effects of other factors were not significant（P>0.05）. The optimal medium for T-1 strain was 1.11% soluble starch， 0.3% yeast extract powder and 0.5% CaCl2. Under the culture conditions of 218 r/min shaker speed， the spore yield of the T-1 strain was higher than that of the original basic medium before optimization. The spore yield increased by 6.25 times. 【Conclusion】Under the optimized fermentation conditions， B. licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching can increase its spore yield greatly compared with the original method. Its stable period of growth also prolongs. Since the optimized media use cheap but high efficient raw materials， the fermentation costs can be reduced. This method can be applied in large-scale production in the future.

Key words： Bacillus licheniformis; media; fermentation conditions; single factor methodology; response surface methodology

0 引言

【研究意義】細(xì)菌的群體感應(yīng)是其自體誘導(dǎo)現(xiàn)象，細(xì)菌通過感知群體感應(yīng)信號(hào)分子，調(diào)控毒力因子表達(dá)及生物膜形成等生理現(xiàn)象（許玉彬等，2013）。群體感應(yīng)淬滅可通過降解群體感應(yīng)信號(hào)分子或抑制其合成而阻斷病原菌毒力基因的表達(dá)，在不殺死病原菌的基礎(chǔ)上有效降低其致病性（王巖等，2017）。目前，群體感應(yīng)淬滅酶包括群體感應(yīng)信號(hào)分子的內(nèi)酯酶、酰基水解酶及氧化酶還原酶3種，其中?；呓z氨酸內(nèi)酯酶是發(fā)現(xiàn)最早和研究最深入的群體感應(yīng)淬滅酶。群體感應(yīng)淬滅酶最早在芽孢桿菌240B1（Bacillus sp. 240B1）中發(fā)現(xiàn)（Dong et al.，2000），隨后陸續(xù)在不同菌屬中發(fā)現(xiàn)多種淬滅酶基因，包括attM、ahlD、ytnP、ahlS和aidH等基因（Zhang et al.，2002;Park et al.，2003;Mei et al.，2010;Morohoshi et al.，2012;Schneider et al.，2012）。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）T-1株是國家水生動(dòng)物病原庫從水產(chǎn)動(dòng)物腸道分離篩選獲得，具有良好的群體感應(yīng)淬滅效果，尤其對(duì)感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚具有良好抗感染能力，具備開發(fā)成抗菌益生菌的潛力（宋增福等，2015;Chen et al.，2019）。因此，優(yōu)化地衣芽孢桿菌T-1株的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，可為更好地利用該菌進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。【前人研究進(jìn)展】目前，關(guān)于芽孢桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化的研究已有較多報(bào)道，且主要采用常規(guī)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。洪劍輝（2015）通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)棘孢小單孢菌產(chǎn)慶大霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后其產(chǎn)慶大霉素B量較原配方提高20%;劉寬博等（2016）使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化枯草芽孢桿菌C3的培養(yǎng)基組成，優(yōu)化后枯草芽孢桿菌C3的活菌數(shù)達(dá)7.1×1010 CFU/mL，細(xì)菌濃度提高7.89倍;邵帥（2016）以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化夏孢生枝孢菌株的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組分，優(yōu)化后的菌株發(fā)酵上清液對(duì)黃曲霉毒素B1的降解率提高1.40倍;Wang等（2017）采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)食用真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后其發(fā)酵液中的黃酮類和可溶性蛋白分別為1.551和0.691 mg/mL;王忠忠和龔國利（2017）以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化短小芽孢桿菌株M01抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝，優(yōu)化后其抑菌活性提高38.7%;葉碧霞等（2017）采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的枯草芽孢桿菌數(shù)達(dá)1.03×1010 CFU/mL;陳海超等（2018）通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化漢遜氏葡糖酸醋桿菌培養(yǎng)條件，優(yōu)化后細(xì)胞膜干重的產(chǎn)量提高3倍;Liu等（2018）采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)巨大芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵液用于作物肥料，能使農(nóng)作物產(chǎn)量提高25.91%;王海德（2018）通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化空氣芽孢桿菌的培養(yǎng)基組成，使其活菌數(shù)高達(dá)7.65×109 CFU/mL，細(xì)菌濃度提高117倍;張同睿（2018）以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)多粘類芽孢桿菌SC2抗細(xì)菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后抗菌物質(zhì)的最終產(chǎn)量約提高4倍?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能給出明確的函數(shù)表達(dá)式以確定整個(gè)區(qū)域的最佳因素組合及最佳響應(yīng)值，難以獲得理想的優(yōu)化效果（李姝江等，2019）;且單因素試驗(yàn)是通過逐個(gè)考察各因素以修正其他因素，但各因素間存在交互作用，因此獲得的最佳條件并非最優(yōu)條件。響應(yīng)面分析是一種回歸分析方法，所求得的回歸方程精度高，能研究多種因素間的交互作用，且周期短和試驗(yàn)次數(shù)少;同時(shí)可建立數(shù)學(xué)模型，通過多元二次回歸方程來解決最優(yōu)組合受多個(gè)變量影響的問題（徐敏強(qiáng)，2018）。因此，利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行微生物培養(yǎng)基優(yōu)化可獲得良好的效果，但至今未見以響應(yīng)面分析法優(yōu)化地衣芽孢桿菌T-1株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)具群體感應(yīng)淬滅作用地衣芽孢桿菌T-1株的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高其產(chǎn)孢量，為后續(xù)開發(fā)地衣芽孢桿菌制劑（抗菌益生菌）打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

地衣芽孢桿菌T-1株由國家水生動(dòng)物病原庫篩選獲得，保藏于中國微生物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC M2014049。LB培養(yǎng)基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2）和LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4）自制，碳源（糖蜜、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麩皮粉和蛋白胨）、氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉、黃豆粉、KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）、無機(jī)鹽（NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2）均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)（SJ-CJ-1FD）、恒溫培養(yǎng)箱（LHP-100）、高速冷凍離心機(jī)（KT7-900-430）、振蕩培養(yǎng)箱（INNOVA 40R）、紫外分光光度計(jì)（UPG-722）和光照培養(yǎng)箱（MGC-350BP）。

1. 2 T-1株最佳培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

1. 2. 1 最佳培養(yǎng)溫度 參考陳海超等（2018）的方法，將過夜培養(yǎng)菌液按1%比例接種到5 mL營養(yǎng)肉湯試管中（pH 7.0），分別置于20、24、28、32、37、42、46和50 ℃的搖床上振蕩培養(yǎng)18 h后測OD600，確定T-1株生長的最佳溫度。每個(gè)溫度組設(shè)3個(gè)平行。

1. 2. 2 最佳pH 參考葉碧霞等（2017）的方法，用1 mol/L HCl或NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，將過夜培養(yǎng)菌液按1%比例接種到5 mL營養(yǎng)肉湯試管中，置于37 ℃搖床上振蕩培養(yǎng)18 h后測OD600，確定T-1株生長的最佳pH。每個(gè)pH設(shè)3個(gè)平行。

1. 2. 3 最佳鹽度 參照胡桂萍等（2018）的方法，將過夜培養(yǎng)菌液按1%比例接種到5 mL營養(yǎng)肉湯試管中（pH 7.0），按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0%的梯度鹽度進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)18 h后測OD600，確定T-1株生長的最佳鹽度。每個(gè)鹽度設(shè)3個(gè)平行。

1. 3 T-1株菌液OD600與活菌數(shù)量的關(guān)系

參考Ushakiranmayi等（2017）的方法，梯度稀釋待測菌液10-3～10-7，取稀釋菌液200 ?L均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度重復(fù)3次，培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)。

1. 4 T-1株生長曲線繪制

參考葉碧霞等（2017）的方法，將T-1株的菌液按1%比例接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)。每4 h測量一次菌液OD600，以未接種菌液的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，繪制T-1株培養(yǎng)時(shí)間與OD600的生長曲線。

1. 5 T-1株活菌數(shù)、芽孢數(shù)與時(shí)間的關(guān)系

活菌數(shù)測定參考葉碧霞等（2017）的方法，將T-1株菌液按1%比例接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，采用稀釋涂布法分別對(duì)培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、36、48、60和72 h后的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度重復(fù)3次，測出各時(shí)段的活菌數(shù)。芽孢數(shù)測定參考Roy等（2013）的方法，將待測菌液置于80 ℃水浴鍋中水浴15 min，然后按活菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度重復(fù)3次，測量各時(shí)段的芽孢產(chǎn)量。

1. 6 發(fā)酵培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)

1. 6. 1 最佳碳源篩選 分別選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麩皮粉和蛋白胨作為唯一碳源（1.0%），以牛肉浸粉為氮源（0.3%），裝液量150 mL，接種量3%，37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)54 h。按照碳源不同設(shè)8個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行，測量菌液OD600及其芽孢產(chǎn)量。

1. 6. 2 最佳氮源篩選 以最佳碳源為碳源（1.0%），選取5種有機(jī)氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黃豆粉）和4種無機(jī)氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）作為氮源（0.3%），裝液量150 mL，接種量3%，37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)54 h。按照碳源不同設(shè)9個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行，測量菌液OD600及其芽孢產(chǎn)量。

1. 6. 3 最佳無機(jī)鹽篩選 在最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上，選取NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7種無機(jī)鹽（0.5%），裝液量150 mL，接種量3%，37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)54 h。按照無機(jī)鹽不同設(shè)7個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行，測量菌液OD600及其芽孢產(chǎn)量。

1. 7 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基成分及配比

1. 7. 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定6個(gè)對(duì)芽孢產(chǎn)量影響較大的因子。采用Minitab 16.0中的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選發(fā)酵培養(yǎng)基中影響芽孢產(chǎn)量的主要因子，依次設(shè)為X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（搖床轉(zhuǎn)速）和X6（接種量），每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平（El-Gherab et al.，2018）。

1. 7. 2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的一次擬合方程確定因素取值中心點(diǎn)，并確定主要因素的爬坡方向和變化步長;然后根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)中菌液芽孢產(chǎn)量的變化趨勢，確定Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)及最適質(zhì)量濃度范圍（El-Gherab et al.，2018）。

1. 7. 3 響應(yīng)面分析 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，確定Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)中主要因素的最適質(zhì)量濃度范圍。采用Minitab 16.0中的Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素優(yōu)化試驗(yàn)，通過響應(yīng)面分析各因素間的相互作用。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，利用Mini-tab 16.0對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面分析結(jié)果進(jìn)行方差分析，并通過最小顯著性差異（LSD）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 T-1株最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1-A可看出，菌液OD600隨培養(yǎng)溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢，于37 ℃時(shí)達(dá)最高值（0.425），即T-1株的最佳生長溫度為37 ℃。由圖1-B可看出，當(dāng)pH由3.0逐漸上升至6.0時(shí)，菌液OD600隨之升高，但pH繼續(xù)上升后菌液OD600開始降低，說明T-1株適合在偏酸性環(huán)境下生長，最佳pH為6.0。由圖1-C可看出，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度為0.5%時(shí)，菌液OD600達(dá)最高值（0.453），但鹽度繼續(xù)增加時(shí)菌液OD600開始降低。由圖1-D可看出，當(dāng)菌液OD600大于0.859后菌液OD600與活菌數(shù)量間的關(guān)系趨于直線變化，當(dāng)菌液OD600為1.604時(shí)，活菌數(shù)量達(dá)5.0×109 CFU/mL。

2. 2 T-1株活菌數(shù)和芽孢產(chǎn)量與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系

由T-1株在37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)的生長曲線（圖2-A）可看出，0～4 h為菌株生長的遲緩期，4～24 h為對(duì)數(shù)增長期，24～48 h菌株生長達(dá)穩(wěn)定期，48 h后為衰亡期。由圖2-B可看出，T-1株的芽孢產(chǎn)量隨搖床培養(yǎng)時(shí)間的延長逐步增加，即與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān);培養(yǎng)至48 h后其活菌數(shù)呈下降趨勢，而芽孢產(chǎn)量依然呈增加趨勢。T-1株的活菌數(shù)在培養(yǎng)48～60 h期間其芽孢產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。

2. 3 T-1株最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 3. 1 最佳碳源篩選 以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麩皮粉和蛋白胨等8種碳源進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果（表1）顯示，可溶性淀粉組和葡萄糖組的菌液OD600較高，分別為1.308和1.200，而糖蜜組和可溶性淀粉組的芽孢產(chǎn)量較高，分別為1.28×108和1.66×108 CFU/mL。綜合生產(chǎn)成本及培養(yǎng)效果，選取可溶性淀粉和糖蜜進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2. 3. 2 最佳氮源篩選 選用5種有機(jī)氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黃豆粉）和4種無機(jī)氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果（表2）顯示，酵母浸粉組的菌液OD600和芽孢產(chǎn)量均最高，分別為1.853和4.30×108 CFU/mL，因此選擇酵母浸粉為最佳氮源。

2. 3. 3 最佳無機(jī)鹽篩選 以可溶性淀粉為碳源、酵母浸粉為氮源，選擇NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7種無機(jī)鹽進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果（表3）顯示，CaCl2組的菌液OD600和芽孢產(chǎn)量均最高，分別為1.930和6.35×108 CFU/mL，因此選擇CaCl2為最佳無機(jī)鹽。

2. 4 響應(yīng)面分析結(jié)果

2. 4. 1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用n=12，對(duì)6個(gè)因素（X1、X2、X3、X4、X5和X6）進(jìn)行分析，并利用Minitab 16.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果（表4）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表5）表明，X2（可溶性淀粉）對(duì)T-1株芽孢產(chǎn)量的影響達(dá)顯著水平（P<0.05，下同），而X5（搖床轉(zhuǎn)速）對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

2. 4. 2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果 由表5可知，X2（可溶性淀粉）對(duì)T-1株芽孢產(chǎn)量具有顯著負(fù)效應(yīng)，因此最陡爬坡試驗(yàn)應(yīng)沿著可溶性淀粉濃度減少的方向進(jìn)行設(shè)計(jì);而X5（搖床轉(zhuǎn)速）對(duì)T-1株芽孢產(chǎn)量具有極顯著正效應(yīng)，因此最陡爬坡試驗(yàn)應(yīng)沿著轉(zhuǎn)速升高的方向進(jìn)行設(shè)計(jì)。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果（表6）表明，在可溶性淀粉1.2%和搖床轉(zhuǎn)速220 r/min附近區(qū)域時(shí)，T-1株的芽孢產(chǎn)量達(dá)最高值（27.7×108 CFU/mL）。

2. 4. 3 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果（表6）設(shè)計(jì)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，其中可溶性淀粉和搖床轉(zhuǎn)速的中心點(diǎn)分別為X1=1.2%和X2=220 r/min，具體因素水平設(shè)計(jì)見表7。對(duì)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果（表8）進(jìn)行方差分析，可知回歸模型的決定系數(shù)為93.54%，P=0.000，失擬項(xiàng)P為0.764，表明擬合得到的回歸模型顯著且無失擬現(xiàn)象。由表9可知，回歸模型的線性和平方對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響達(dá)顯著水平，而交互作用對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響不顯著;擬合得到的二次回歸方程為Y芽孢產(chǎn)量=10.52+0.51X1-329.20X2-1.05X12-1.05X22+0.075X1X2。

利用響應(yīng)優(yōu)化器對(duì)擬合的二次回歸方程進(jìn)行求值（圖4），得知當(dāng)X1=1.11%、X2=218.43 r/min時(shí)，Y芽孢產(chǎn)量達(dá)最大值（10.59）。為進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面分析結(jié)果，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示T-1株芽孢產(chǎn)量的平均值為（10.52±4.50）×108 CFU/mL，與理論預(yù)測值相近，說明該回歸模型預(yù)測結(jié)果可靠。與優(yōu)化前采用初始基礎(chǔ)培養(yǎng)基的T-1株芽孢產(chǎn)量（2.15×108 CFU/mL）相比，優(yōu)化后的T-1株芽孢產(chǎn)量提高6.25倍。

3 討論

抗生素是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)常用的化學(xué)防治藥物，但抗生素易使菌株產(chǎn)生耐藥性，毒副作用強(qiáng)且存在環(huán)境污染等缺點(diǎn)，歐盟已于2006年全面停止使用抗生素作為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)（倪軍等，2018），即目前迫切需要一種新型安全綠色無污染的抗菌制劑來替代抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，尤其在生態(tài)環(huán)境和食品安全越來越受到重視的背景下，加快新型抗菌制劑的研制對(duì)促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。在本課題組前期的研究基礎(chǔ)上，本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)地衣芽孢桿菌T-1株的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，以酵母浸粉為唯一氮源，T-1株的芽孢產(chǎn)量最高（4.30×108 CFU/mL），是由于酵母浸粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸類、肽類、核苷酸、B族維生素和微量元素，與朱天輝等（2013）的研究結(jié)果一致;以CaCl2為唯一無機(jī)鹽時(shí)，T-1株的芽孢產(chǎn)量明顯高于其他無機(jī)鹽，是由于Ca2+在細(xì)胞中控制其體內(nèi)的滲透壓，且Ca2+是某些生物酶的激活劑，能保障細(xì)胞正常的機(jī)體功能和酶活特性，與林陳強(qiáng)等（2011）的研究結(jié)果一致。

本研究基于單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)，篩選出對(duì)T-1株芽孢產(chǎn)量影響顯著的2個(gè)因素分別是可溶性淀粉和搖床轉(zhuǎn)速，并通過最陡爬坡試驗(yàn)找出這2個(gè)因素的中心點(diǎn)，然后利用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。結(jié)合T-1株的生物學(xué)特性及其培養(yǎng)基優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)在溫度37 ℃、pH 6.0、可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%、CaCl2 0.5%、搖床轉(zhuǎn)速218 r/min的條件下培養(yǎng)54 h，其芽孢產(chǎn)量為10.59×109 CFU/mL，較優(yōu)化前初始基礎(chǔ)培養(yǎng)基的菌株芽孢產(chǎn)量提高6.25倍。優(yōu)化后的培養(yǎng)基能有效提高地衣芽孢桿菌T-1株發(fā)酵產(chǎn)孢數(shù)量，保證微生態(tài)制劑的含菌量;此外，優(yōu)化篩選出的培養(yǎng)基是采用相對(duì)廉價(jià)且高效的原材料，有效節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵成本，可在規(guī)?；a(chǎn)上推廣應(yīng)用。

李冠杰等（2018）研究表明，地衣芽孢桿菌YDY株的最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度 37 ℃、pH 8.0、接種量體積分?jǐn)?shù)1%。王珊珊等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌LS-1株的最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度40 ℃、初始pH 12.0、接種量體積分?jǐn)?shù)4%。在本研究的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，地衣芽孢桿菌T-1株的生長對(duì)數(shù)期為4～24 h，即收集菌體的最佳時(shí)間為18～24 h，48 h后開始進(jìn)入衰亡期，與劉瑩等（2006）研究發(fā)現(xiàn)T-1株從培養(yǎng)21 h后進(jìn)入衰亡期的結(jié)論相比，極大延長了地衣芽孢桿菌生長的穩(wěn)定期。T-1株在溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速218 r/min的條件下培養(yǎng)48 h，其芽孢產(chǎn)量可達(dá)最大值，與解順昌等（2015）的研究結(jié)果基本一致?？梢姡煌甑淖罴寻l(fā)酵培養(yǎng)條件也不同，且差距較大，但具體原因有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

具群體感應(yīng)淬滅作用地衣芽孢桿菌T-1株在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，其芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前明顯提高6.25倍，且延長菌株生長的穩(wěn)定期，加上優(yōu)化篩選出的培養(yǎng)基是采用相對(duì)廉價(jià)且高效的原材料，有效節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵成本，可在規(guī)?；a(chǎn)上推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）