林勇 劉俊鋒 唐小巒 張月芬 戴推彬

摘要：【目的】凝集素是竹蓀的一類生理活性物質(zhì)，為進(jìn)一步明確其藥用功效，開展了長裙竹蓀凝集素理化性質(zhì)研究?！痉椒ā块L裙竹蓀菌絲體通過生理鹽水抽提、20%～75%飽和度的硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose和SephadexG-100柱層析純化得到長裙竹蓀菌絲體凝集素（DIL）;并通過血細(xì)胞凝集活性、糖抑制試驗、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性分析以及金屬離子等因素來測定長裙竹蓀菌絲體凝集素的理化性質(zhì)?！窘Y(jié)果】經(jīng)PAGE顯示單一條帶，測得其亞基相對分子質(zhì)量為43.6kDa。該凝集素對供試的鴿、兔、鴨和雞血紅細(xì)胞具有凝集作用，對兔紅細(xì)胞的凝集作用可被D-半乳糖和N-乙酰胺基-葡萄糖所抑制。長裙竹蓀凝集素對熱不穩(wěn)定，經(jīng)50℃處理10min，活性明顯降低;該凝集素在pH 4.0-8.0都保持著較高的凝集活性，其凝血活性依賴于Ca²⁺和Mg²⁺二價金屬離子，Mn²⁺和Zn²⁺則無影響。[結(jié)論]長裙竹蓀菌絲體凝集素對動物血紅細(xì)胞具有較好的凝集活性，而且凝集活性需要在一定濃度的Ca²⁺和Mg²⁺才會起作用。

關(guān)鍵詞：凝集素;長裙竹蓀;分離純化;理化性質(zhì)

中圖分類號：S646 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）11-1342-05

0 引言

【研究意義】竹蓀，亦稱竹參、竹菌、竹笙，是一類大型真菌。長裙竹蓀Dictyophora indusiata為竹蓀屬模式種，在真菌分類學(xué)上，屬擔(dān)子菌亞門，腹菌綱，鬼筆菌目，鬼筆菌科[1]，具有較好的食用、保健兼藥用價值。凝集素是一種可以從植物、動物或微生物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凝集、免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞生長、血型鑒定和高分子化合物的篩選、純化等方面都發(fā)揮著重要的作用[2]，而凝集素也是竹蓀中所含的一類重要的生理活性物質(zhì)，具有重要的研究和開發(fā)價值。【前人研究進(jìn)展】近年來，國內(nèi)外有報道表明，從食用菌子實體或菌絲體中分離得到的特異構(gòu)型的活性蛋白和多糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)在免疫功能的調(diào)節(jié)、腫瘤因子的抑制以及抑菌防腐功能中都扮演著重要的角色，其功效都與凝集素有著密切的關(guān)系[3-8]。目前從動植物中已分類純化的凝集素有100多種，其中大部分做成產(chǎn)品[4];從真菌廣泛分布地區(qū)采集了403種，用人紅細(xì)胞和兔紅細(xì)胞檢測凝集素，其中50%含有凝集素[9]，其研究價值不斷提高，受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注?！颈狙芯壳腥朦c】因此，對食用菌凝集素的深入研究，可以更好地開發(fā)應(yīng)用這一寶貴生物資源提供科學(xué)依據(jù)。目前，對竹蓀的研究主要集中在其栽培及抗菌活性上，對竹蓀凝集素的研究僅發(fā)現(xiàn)林玉滿和蘇愛華對其子實體凝集素的報道[4，10]，而從長裙竹蓀菌絲體中分離純化凝集素的相關(guān)研究，至今還尚未見到報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用液體發(fā)酵培養(yǎng)長裙竹蓀，開展長裙竹蓀菌絲體凝集素提取分離和理化性質(zhì)的研究，以期為長裙竹蓀菌絲體凝集素生物學(xué)活性研究利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 長裙竹蓀Dictyophora indusiata Fisscher菌株由福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 玉米淀粉20g，黃豆粉10g，葡萄糖20g，酵母膏5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g、維生素B150mg·L^-1，調(diào)整pH至6.0，分裝三角瓶中高壓滅菌（121℃，20min）。

1.1.3 動物血紅細(xì)胞及其懸液制備 兔血、鴿血、雞血、鴨血采購自福州農(nóng)貿(mào)市場。各種動物血樣中分別加入檸檬酸鈉抗凝劑，通過離心去除血漿，用生理鹽水將血紅細(xì)胞洗滌4～5次，配制的紅細(xì)胞懸液的含量最終達(dá)到2%。

1.1.4 試劑 試劑Sephadex G-100、DEAF-SephroseFast Flow、蛋白質(zhì)Marker分別購自Pharmacia公司、北京鼎國生物技術(shù)有限公司和購自Fermentas公司;其他常規(guī)藥品、試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.5 儀器 ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器、冷凍干燥機(jī)、L-550型低速臺式離心機(jī)。

1.2 試驗方法

1.2.1 長裙竹蓀菌絲體的培養(yǎng) 將試管斜面長裙竹蓀菌種接人裝有已滅菌冷卻50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)5d，而后采用180r·min^-1搖床28℃培養(yǎng)7d，終止發(fā)酵，用4層紗布過濾，菌絲體用高純水沖洗，重復(fù)3次，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 長裙竹蓀菌絲體凝集素的分離和純化 長裙竹蓀菌絲體按質(zhì)量/體積比為1：3（即w/v=1/3）加入生理鹽水在4℃下浸泡18h，用高速組織搗碎機(jī)勻漿后在4℃下繼續(xù)浸提6h，勻漿4℃下冷凍離心（8000r·min^-1，20min），取出上清液備用。通過20%～75%飽和度的硫酸銨沉淀，收集沉淀部分，將沉淀溶于少量的PBS緩沖液（0.05mol·L^-1，pH=6.8）中，并裝入透析袋除鹽，隨后用同一種緩沖液再透析，直到外透析液中SO₄^2-離子低于檢測限以下為止。聚乙二醇濃縮后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱（1.6cm×30cm）以磷酸鹽緩沖液（0.05mol·L^-1，pH=6.8）進(jìn)行梯度洗脫，分管收集，檢測波長為280nn，采用鴿子血檢測各洗脫峰的血凝活性，收集活性峰。第一次收集的活性峰經(jīng)Sephadex G-100柱（1.6cm×60cm）柱再次進(jìn)行層析提純，以4mL·管^-1的流速進(jìn)行，時間為10min·管^-1，以磷酸緩沖液（0.05mol·L^-1，pH=7.2）進(jìn)行洗脫，分管收集后依次檢測各峰的凝血活性，采用冷凍干燥處理活性峰，得菌絲體凝集素純品。

1.2.3 SDS-PAGE測定長裙竹蓀菌絲體凝集素亞基相對分子質(zhì)量 凝膠電泳參考Laemmli[11]的方法，分離膠和濃縮膠的含量分別為15%和5%，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色[12]。

1.2.4 長裙竹蓀菌絲體凝集素的血凝活性 根據(jù)孫冊的方法[2]，采用“V”型血凝板進(jìn)行血凝活性測定，首先用等量的PBS對20μL質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的凝集素溶液進(jìn)行不同倍比的稀釋，然后分別加20μL2%的不同動物血紅細(xì)胞，在室溫下將混合液振蕩搖勻后放置2h，對試驗結(jié)果進(jìn)行實時觀察和記錄，當(dāng)凝集反應(yīng)出現(xiàn)時記錄下此時的最大稀釋倍比。

1.2.5 糖抑制試驗 將10mg·mL^-1長裙竹蓀菌絲體凝集素不同倍數(shù)稀釋后，分別添加在“V”型血凝板上，然后加入40mmol·L^-1的各種糖溶液混合1h后，再加入20μL2%鴿血紅血細(xì)胞，振蕩搖勻后放置于室溫下2h，觀察其凝集結(jié)果。

1.2.6 酸堿穩(wěn)定性分析 參照Ahmed and Chatterjee的方法配制pH4.0～10.0的不同系列緩沖液，在設(shè)定的pH條件下測定長裙竹蓀菌絲體凝集素的血凝活力。pH4.0～6.0，采用0.015mol·L^-1的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液;pH6.5～7.5，采用0.015mol·L^-1的磷酸鹽緩沖液;pH8.0～9.0，采用0.015mol·L^-1的三乙醇胺鹽緩沖液，pH10.0采用0.015mol·L^-1的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。將長裙竹蓀菌絲體凝集素分別在上述各種鹽緩沖液中配制成質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的溶液，然后用2%的鴿血紅細(xì)胞在“V”型血凝板上檢測其凝集活性。

1.2.7 熱穩(wěn)定性分析 設(shè)置8個溫度梯度，每10℃為1個梯度，即30，40，50，60，70，80，90，100℃。將質(zhì)量濃度為1mg·mL^-1的長裙竹蓀菌絲體凝集素溶液，分別置于以上不同溫度的水浴下處理10min，然后用純水對樣品進(jìn)行冷卻至室溫為止，同時對凝集素的血凝活性進(jìn)行檢測。

1.2.8 金屬離子對長裙竹蓀菌絲體凝集素的影響根據(jù)林玉滿等[10]的方法，設(shè)定溫度為4℃，在透析袋中加入10mg·mL^-1的長裙竹蓀菌絲體凝集素，同時把透析袋放置于20mmol·L^-1的EDTA-Na₂溶液中進(jìn)行充分透析，獲得不含金屬離子的菌絲體凝集素溶液，再通過生理鹽水作不同倍比稀釋后，分別加入10mmol·L^-1的4種二價金屬離子（Ca²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺），各自檢測凝集素對鴿血紅細(xì)胞的凝血活性。將沒有處理的長裙竹蓀菌絲體凝集素溶液和經(jīng)EDTA處理的菌絲體凝集素溶液作為對照。

2 結(jié)果和分析

2.1 長裙竹蓀菌絲體凝集素的分離和純化

長裙竹蓀菌絲體凝集素粗品經(jīng)DEAE-Fast Flow離子交換層析，得到2個洗脫峰（圖1），經(jīng)血凝活性測定，其中峰2部分具有凝血活性，該活性部分經(jīng)Sephadex G-100柱進(jìn)一步純化，得到3個洗脫峰（圖2）;經(jīng)血凝活性試驗，發(fā)現(xiàn)第2峰具有血凝活性，而第1峰則無活性。將第2洗脫峰的洗脫液收集后進(jìn)行透析除鹽，經(jīng)冷凍干燥后得到長裙竹蓀菌絲體凝集素純品DIL。

2.2 長裙竹蓀菌絲體凝集素亞基相對分子質(zhì)量測定

如圖3所示，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，長裙竹蓀菌絲體凝集素所得為單一條帶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算得到長裙竹蓀菌絲體凝集素亞基的相對分子質(zhì)量為43.6kDa。

2.3 長裙竹蓀菌絲體凝集素的血細(xì)胞凝集活性分析

將長裙竹蓀菌絲體凝集素配制成初始質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的溶液，經(jīng)過不同倍數(shù)稀釋后測定其對鴿、兔、雞、鴨血的凝血活性，結(jié)果表明：長裙竹蓀菌絲體凝集素對4種供試動物血細(xì)胞均有一定的凝集作用（表1），但凝集素對不同種類血細(xì)胞的凝集能力有差異，其對鴿血血細(xì)胞的凝集活性最強（活性達(dá)到2¹⁰），最低凝集質(zhì)量濃度為9.8μg·mL^-1，對雞血細(xì)胞的凝集作用最差（活性僅為2³），最低凝集質(zhì)量濃度為1.25mg·mL^-1。

2.4 長裙竹蓀菌絲體凝集素的糖抑制實驗

如表2所示，經(jīng)過倍比稀釋，起始質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的長裙竹蓀菌絲體凝集素的糖抑制試驗結(jié)果表明：凝集素對鴿紅細(xì)胞的凝集活性可被D-半乳糖和N-乙酰胺基-葡萄糖所抑制，但抑制程度有差異，而其他供試的4種糖對長裙竹蓀菌絲體凝集素的凝集活性無抑制作用。

2.5 長裙竹蓀菌絲體凝集素的酸堿穩(wěn)定性分析

長裙竹蓀菌絲體凝集素起始質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1，如表3所示，在pH3.0～10.0緩沖系統(tǒng)中的穩(wěn)定性測定結(jié)果表明，其凝集活性在pH4.0～8.0，凝集活性最高;但當(dāng)pH為3.0或9.0～10.0時，其凝集活性下降較為明顯。

2.6 長裙竹蓀菌絲體凝集素的熱穩(wěn)定性分析

經(jīng)過30℃～80℃的不同溫度處理后，菌絲體凝集素對鴿血細(xì)胞的凝集活性結(jié)果如表4所示，當(dāng)處理溫度達(dá)到50℃時低質(zhì)量濃度凝集素的凝集活性開始部分下降;當(dāng)處理溫度達(dá)到70℃，長裙竹蓀菌絲體凝集素對鴿血紅細(xì)胞失去凝集活性，這表明長裙竹蓀菌絲體凝集素對溫度的耐受性較低。

2.7 金屬離子對長裙竹蓀菌絲體凝集素凝集活性的影響

測定二價金屬離子對長裙竹蓀菌絲體凝集素凝集活性影響的結(jié)果，如表5所示，結(jié)果表明：長裙竹蓀菌絲體凝集素對鴿血紅細(xì)胞的凝集活性與金屬離子有一定相關(guān)性。采用EDTA-Na₂將長裙竹蓀菌絲體凝集素中的金屬離子去除后，則凝集素活性隨之消失，然而在去除金屬離子的長裙竹蓀菌絲體凝集素溶液中，分別再加入Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺二價金屬離子，Ca²⁺和Mg²⁺的離子濃度為10mmol·L^-1，可恢復(fù)長裙竹蓀菌絲體凝集素至較高的活性水平，而Zn²⁺和Mn²⁺對其活性則無影響，這說明長裙竹蓀菌絲體凝集素凝集活性需要一定濃度的Ca²⁺和Mg²⁺才會起作用。

3 討論與結(jié)論

本研究利用液體發(fā)酵培養(yǎng)得到長裙竹蓀菌絲體，從菌絲體中提取并分離純化得到長裙竹蓀菌絲體凝集素（DIL）。與傳統(tǒng)的人工栽培長裙竹蓀（子實體）相比，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)獲取長裙竹蓀菌絲的模式培養(yǎng)周期短、不受氣候影響的優(yōu)點，能較容易地提供大量原料資源用于提取長裙竹蓀菌絲體凝集素，為今后可能的工業(yè)化生產(chǎn)提供了保證。本研究測定的長裙竹蓀菌絲體凝集素亞基的相對分子質(zhì)量為43.6kDa，略小于林玉滿等[10]報道的棘托竹蓀子實體凝集素的亞基;并且長裙竹蓀菌絲體凝集素對溫度的耐受性較低，對熱不穩(wěn)定，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道的一致，但是本研究分離純化的長裙竹蓀菌絲體凝集素在溫度70℃時失去活性，略高于林玉滿等[10]（60℃）的報道。

凝集素能與糖類分子專一性結(jié)合，這也是凝集素重要的特征之一，凝集素的糖結(jié)合位點的形狀、大小、糖決定簇在糖鏈中的位置及配體糖的構(gòu)象在這種專一性結(jié)合中起著決定性的作用[14]。糖對長裙竹蓀菌絲體凝集素抑制試驗表明，供試的D-半乳糖和N-乙酰胺基-葡萄糖能抑制其對鴿血紅細(xì)胞的凝集活性，而D-甘露糖、D-海藻糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖對長裙竹蓀菌絲體凝集素的凝集活性無抑制作用，這與長裙竹蓀菌絲體凝集素結(jié)合細(xì)胞受體的糖結(jié)合專一性有關(guān)。根據(jù)這一特性，以后對長裙竹蓀菌絲體凝集素的純化可以采用含有D-半乳糖或N-乙酰胺基-葡萄糖單糖鏈的親和層析，以提高純化效率。

在測定二價金屬離子Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺對長裙竹蓀菌絲體凝集素的凝集活性影響的過程中發(fā)現(xiàn)，長裙竹蓀菌絲體凝集素對鴿血紅細(xì)胞的凝集活性依賴于一定濃度的Ca²⁺和Mg²⁺，Mg²⁺和Mn²⁺對其活性則無影響，這與林玉滿和蘇愛華[14]所報道的二價金屬離子對短裙竹蓀凝集素凝集活性的影響結(jié)果一致。

有關(guān)真菌凝集素對小鼠的急性毒性的研究報道較少，而且有報道指出，棘托竹蓀凝集素[10]對小鼠的半致死劑量顯著低于草菇凝集素[15]和楊樹菇凝集素[16]。因此，后續(xù)的工作我們將重點開展長裙竹蓀菌絲體凝集素對小鼠的急性毒性的研究，為進(jìn)一步研發(fā)相關(guān)系列產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林海清）

收稿日期：2019-10-30初稿;2019-11-15修改稿

作者簡介：林勇（1970-），男，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物研究與應(yīng)用（E-mail：lforesty@163.com）

基金項目：福建省科技計劃公益類專項（201581020-4）;福建省科技特派員項目（閩財指[2019]476號）