陶勇 陸建豪 任善茂

摘要：【目的】探討IGFBP2基因潛在的遺傳變異及其與蘇姜豬肉質(zhì)性狀之間的關(guān)系?！痉椒ā坎捎肞CR-RFLP技術(shù)檢測(cè)IGFBP2基因在蘇姜豬、姜曲海豬、杜洛克豬中的Msp I酶切遺傳多態(tài)性，采用單因素方差分析法分析該多態(tài)位點(diǎn)對(duì)蘇姜豬肉質(zhì)性狀的影響?！窘Y(jié)果】在3個(gè)豬種試驗(yàn)群體，IGFBP2基因第2內(nèi)含子內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了1個(gè)Msp I酶切多態(tài)性，存在A、B等位基因，AA、AB、BB基因型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锽，優(yōu)勢(shì)基因型為AB，多態(tài)信息含量均呈現(xiàn)中度多態(tài)。蘇姜豬試驗(yàn)群體IGFBP2基因AA、AB型個(gè)體大理石紋顯著高于BB型（P<0.05），AA型個(gè)體五分制肉色和色差儀測(cè)得的a值均顯著高于AB、BB型（P<0.05）?！窘Y(jié)論】蘇姜豬試驗(yàn)群體IGFBP2基因第2內(nèi)含子內(nèi)PCR-RFLP-Msp I多態(tài)性與部分肉質(zhì)性狀間存在一定程度的顯著性相關(guān)，可以作為與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因加以研究。

關(guān)鍵詞：豬;IGFBP2基因;PCR-RFLP-Msp I;肉質(zhì)性狀;關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）11-1283-05

0 引言

【研究意義】胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2（Insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2）屬于IGFBPs家簇，在動(dòng)物外周循環(huán)和細(xì)胞外液中廣泛存在，在脂肪形成過程中發(fā)揮著十分重要的作用[1-2]。IGFBP2與胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2）有較高的親和力，與IGF2結(jié)合后將其轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解，以調(diào)節(jié)IGF2的含量，并能抑制IGF2與MDBK細(xì)胞表面結(jié)合，進(jìn)而抑制它們促有絲分裂活性功能[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有研究報(bào)道IGFBP2基因多態(tài)性與動(dòng)物生產(chǎn)性能、經(jīng)濟(jì)性狀間存在關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)了一些影響肉質(zhì)性狀的SNPs與QTLs。楊華等[4]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在大白豬×梅山豬雜交豬試驗(yàn)群體中IGFBP2基因第2內(nèi)含子內(nèi)存在1個(gè)C-T堿基突變，引起Msp I酶切位點(diǎn)的改變，關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)位點(diǎn)與胭體性狀、肉質(zhì)性狀間存在顯著相關(guān)關(guān)系。Rohrer等[5]采用182個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記掃描了370頭杜洛克豬X長(zhǎng)白豬F2代群體的基因組，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)豬15號(hào)染色體上IGBFP2基因所在區(qū)域內(nèi)與大理石紋和嫩度相連鎖的QTL位點(diǎn)可以用來提高豬肉品質(zhì)。Prasongsook等[6]在美國(guó)密歇根州立大學(xué)杜洛克豬X皮特蘭豬F2代資源群體中研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP2基因不同基因型對(duì)失水率、pH₂₄、肉色、多汁性和嫩度等肉質(zhì)性狀有顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蘇姜豬是以地方品種姜曲海豬為母本，導(dǎo)人杜洛克豬血統(tǒng)，運(yùn)用常規(guī)育種與現(xiàn)代分子遺傳育種手段相結(jié)合的方法培育而成的瘦肉型新品種豬，并于2013年成功通過國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)審定，獲得畜禽新品種證書。目前，關(guān)于蘇姜豬的研究主要集中在生產(chǎn)性能、屠宰測(cè)定等方面[7-8]，候選基因及其多態(tài)性與肉質(zhì)性狀等性能之間相關(guān)關(guān)系的研究報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了尋找與蘇姜豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，本試驗(yàn)采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)3個(gè)豬種IGFBP2基因Msp I酶切片斷多態(tài)性，并分析了蘇姜豬不同基因型間肉質(zhì)性狀的差異，以期為蘇姜豬持續(xù)選育及分子標(biāo)記輔助選擇研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 蘇姜豬447頭飼養(yǎng)于江蘇蘇姜種豬有限公司，姜曲海豬109頭飼養(yǎng)于江蘇姜曲海種豬場(chǎng)，杜洛克豬218頭飼養(yǎng)于常州市康樂農(nóng)牧有限公司。同一公司內(nèi)飼養(yǎng)的育肥期試驗(yàn)豬日齡、體重相近，公母各半，飼糧營(yíng)養(yǎng)水平相同，飼養(yǎng)管理方式一致。

1.1.2 主要試劑與儀器 Msp I限制性內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司，KAPA DNA快速提取試劑盒購(gòu)自上海捷易生物科技有限公司。主要儀器包括Q5000超微量核酸蛋白測(cè)定儀、ABI Veriti 96梯度PCR儀、WSC-S測(cè)色色差計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織樣采集與DNA提取所有試驗(yàn)豬在育肥結(jié)束銷售前逐頭采集耳組織樣0.5g，置于裝有70%酒精的Eppendorf管內(nèi)，冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。按照DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 肉質(zhì)性狀測(cè)定 蘇姜豬體重達(dá)100kg左右時(shí)，每個(gè)基因型選取8頭進(jìn)行屠宰，從左半側(cè)胭體倒數(shù)第3～4胸椎處向后采集背最長(zhǎng)肌20～30cm，按照“NY/T821-2004豬肌肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)范”測(cè)定剪切力、失水率、肉色、pH₂₄、大理石紋等肉質(zhì)性狀指標(biāo)。其中肉色采取5分制比色板評(píng)分法和WSC-s色差儀法2種方法測(cè)量，色差儀測(cè)的L值代表光反射值，a值和b值分別代表紅度和黃度值。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 根據(jù)楊華等[4]研究成果，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成一對(duì)引物，擴(kuò)增IGFBP2基因第2內(nèi)含子內(nèi)245 by片段。引物序列分別為：上游，5'-GGTCT GATTG GAGGG GTGT-3';下游，5'-AGCCA AGGAG AAATG TGAAG G-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：DNA模板2.5μL，2×TaqPCR Mix 12.5μL，上下游引物（10μmol·L^-1）各1.0μL，加ddH₂O至總體積25.0μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，共計(jì)35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min，并在4℃條件下保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增效果。

1.2.4 PCR-RFLP-Msp I酶切分析 符合要求的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Msp I進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系包括1×Buffer 1.5μL，Msp I限制性內(nèi)切酶0.2μL（5U），PCR產(chǎn)物5μL，加ddH₂O至總體15μL，37℃酶切反應(yīng)2h。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Msp I酶切的產(chǎn)物，并凝膠成像系統(tǒng)下判斷基因型類型。按照劉海霞等[9]研究方法計(jì)算3個(gè)豬種試驗(yàn)群體內(nèi)的純合度（H₀）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（N_e）、多態(tài)信息含量（PIC），并比較分析IGFBP2基因不同基因型對(duì)蘇姜豬肉質(zhì)性狀的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0GLM對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGFBP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

IGFBP2基因第2內(nèi)含子目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。從圖1可見PCR產(chǎn)物的特異性非常好，擴(kuò)增片段與目標(biāo)片段大小一致，長(zhǎng)度245bp，可以直接用來進(jìn)行RFLP分析。

2.2 IGFBP2基因PCR-RFLP檢測(cè)分型

對(duì)3個(gè)豬種IGFBP2基因目標(biāo)片斷的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RFLP-Msp I分析，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖20結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGFBP2基因PCR產(chǎn)物在3個(gè)豬種試驗(yàn)群體中均檢測(cè)到了Msp I酶切多態(tài)性，存在AA、AB和BB 3種基因型。

2.3 IGFBP2基因遺傳多態(tài)性分析

2.3.1 等位基因和基因型頻率 統(tǒng)計(jì)3個(gè)豬種試驗(yàn)群體IGFBP2基因目標(biāo)片段的等位基因和基因型頻率（表1）。由表1可知，3個(gè)豬種試驗(yàn)群體中優(yōu)勢(shì)基因型均為AB，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锽。

23.2 純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量3個(gè)豬種試驗(yàn)群體H₀、He、Ne及PIC的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可知，3個(gè)豬種試驗(yàn)群體的PIC均呈現(xiàn)中度多態(tài)，且姜曲海豬試驗(yàn)群體的遺傳多樣性高于蘇姜豬、杜洛克豬試驗(yàn)群體。

2.4 IGFBP2不同基因型對(duì)蘇姜豬肉質(zhì)性狀的影響

蘇姜豬IGFBP2基因不同基因型個(gè)體間肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析見表3。由表3可知，AA、AB型個(gè)體大理石紋顯著高于BB型（P<0.05），AB、BB型與AA型個(gè)體的五分制肉色和色差儀測(cè)得的a值間的差異達(dá)到顯著水平（P<0.05），其余指標(biāo)間的差異均不顯著（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

IGFBP2是胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growthfactor，IGF）家族中的一種結(jié)合蛋白，主要存在于動(dòng)物組織和體液中，可參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，與細(xì)胞粘附、瘤血管形成密切相關(guān)[10]。IGFBP2的研究主要集中在人類醫(yī)學(xué)方面，許多腫瘤組織都有IGFBP2表達(dá)或表達(dá)水平升高，表明IGFBP2可能是一種腫瘤的分化程度的標(biāo)志物[11-12]。

前期IGFBP2基因的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)與功能方面，目前有關(guān)IGFBP2基因多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)研究逐漸增多。Zhao等[13]測(cè)序發(fā)現(xiàn)IGFBP2基因第2內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)存在2個(gè)SNPs（C1107G、C11-30T）與兩個(gè)插入/缺失片段（552bp后TC，1115bp后GCCAGGT），京海黃雞試驗(yàn)群體中AA型個(gè)體的出雛重、12周齡體重顯著高于AB型個(gè)體，A等位基因?qū)€(gè)體體重有正面影響，并由此推測(cè)IGFBP2基因內(nèi)含子2區(qū)域的突變可以用作京海黃雞體重的遺傳標(biāo)記。Wang等[14]將豬IGFBP2基因定位于15號(hào)染色體（15q22-23），中國(guó)地方豬種攜帶的A等位基因（50%以上）比歐洲豬種要高，不同基因型個(gè)體間在前軀重、后軀重、前肢重、后肢重等生產(chǎn)性能間差異均達(dá)到顯著或極顯著水平。

本研究在蘇姜豬、姜曲海豬、杜洛克豬等3個(gè)試驗(yàn)群體中均發(fā)現(xiàn)IGFBP2基因第2內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)存在著1個(gè)MspI酶切位點(diǎn)多態(tài)性，獲得A、B2個(gè)等位基因，AB、AB、BB3種基因型。蘇姜豬試驗(yàn)群體的多態(tài)信息含量為0.36，呈現(xiàn)出中度多態(tài)，由此可見蘇姜豬群體具備進(jìn)一步選育的潛力。蘇姜豬IGFBP2基因不同基因型個(gè)體在大理石紋、肉色兩個(gè)指標(biāo)中存在顯著差異，AA型個(gè)體的大理石紋、肉色均顯著高于BB型，這些結(jié)果與楊華等[4]、劉海霞等[9]的研究結(jié)論相似，但與Prasongsook等[6]在部分肉質(zhì)指標(biāo)間存在差異。Prasongsook等研究發(fā)現(xiàn)國(guó)外雜交商品豬群體中IGFBP2基因不同基因型的失水率、pH值、肉色等性狀均達(dá)到了顯著水平，而本試驗(yàn)中卻沒有發(fā)現(xiàn)蘇姜豬試驗(yàn)群體在不同基因間的失水率、pH值存在顯著差異，這可能與試驗(yàn)豬的品種、數(shù)量、飼養(yǎng)管理、測(cè)定方法等因素存在著一定的關(guān)系。由于試驗(yàn)條件的限制，本研究無法分析IGFBP2基因第2內(nèi)含子內(nèi)PCR-RFLP-Msp I多態(tài)位點(diǎn)對(duì)姜曲海豬、杜洛克豬肉質(zhì)性狀的影響，等試驗(yàn)條件具備后可作進(jìn)一步的分析與探討。

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（責(zé)任編輯：張梅）

收稿日期：2019-06-26初稿;2019-09-04修改稿

作者簡(jiǎn)介：陶勇（1975-），男，博士，副教授，主要從事畜禽遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用研究（E-mail：tyrsm1975tt@126.com）

通信作者：任善茂（1976-），女，副教授，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)的教學(xué)、科研與服務(wù)（E-mail：825587062@qq.com）

基金項(xiàng)目：江蘇高?！扒嗨{(lán)工程”資助項(xiàng)目[2017（15）];江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科研項(xiàng)目（NSF201602）