呂珊 張荻

摘要：【目的】從蛋白質(zhì)組學(xué)層面揭示植物胚性細(xì)胞對(duì)超低溫保存復(fù)合逆境的響應(yīng)調(diào)控機(jī)制，篩選出百子蓮胚性愈傷組織在超低溫保存中的差異表達(dá)蛋白，進(jìn)一步豐富觀賞植物超低溫保存的分子生物學(xué)理論。【方法】利用iTRAQ技術(shù)鑒定百子蓮胚性愈傷組織在超低溫保存四個(gè)關(guān)鍵步驟（預(yù)培養(yǎng)、玻璃化脫水處理、洗滌和恢復(fù)培養(yǎng)）中的差異表達(dá)蛋白，應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法構(gòu)建細(xì)胞響應(yīng)超低溫保存復(fù)合逆境的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出植物超低溫逆境保護(hù)類蛋白?！窘Y(jié)果】共鑒定到2730種蛋白，篩選出821個(gè)差異表達(dá)蛋白。GO功能注釋分析結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白主要參與代謝、細(xì)胞過(guò)程和刺激應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程，而催化活性和分子結(jié)合是最主要的分子功能類別。KEGG通路分析結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白主要富集于能量代謝、蛋白的合成與降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞質(zhì)膜修復(fù)等通路。通過(guò)STRING軟件構(gòu)建差異表達(dá)蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)蛋白主要參與糖代謝、氧化還原過(guò)程和核糖體翻譯過(guò)程，下調(diào)表達(dá)蛋白主要參與ROS代謝、DNA修復(fù)、抑制細(xì)胞程序性死亡過(guò)程和細(xì)胞骨架。此外，篩選到96個(gè)與逆境保護(hù)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，分別參與能量代謝、氧化還原平衡、蛋白質(zhì)合成與降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?！窘Y(jié)論】在超低溫保存過(guò)程中，百子蓮胚性愈傷組織的能量代謝、氧化應(yīng)激與蛋白降解及PCD有所加劇，而細(xì)胞的ROS清除和脅迫防御過(guò)程明顯下降，即百子蓮胚性愈傷組織在超低溫復(fù)合逆境下形成以糖代謝和抗氧化系統(tǒng)為主的抗逆保護(hù)機(jī)制。

關(guān)鍵詞： 百子蓮;胚性愈傷組織;蛋白質(zhì)組學(xué);超低溫保存;差異表達(dá)蛋白

中圖分類號(hào)： S682.19? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）11-2410-11

Proteomics analysis of embryogenic callus of Agapanthus praecox during cryopreservation

LYU Shan， ZHANG Di*

（School of Design， Shanghai Jiaotong University， Shanghai? 200240， China）

Abstract：【Objective】The aim of the study was to reveal the response and protection mechanism of plant embryogenic cells under complex stress during cryopreservation on the proteomics level， and to find the differentially expressed proteins（DEPs） during cryopreservation of embryogenic callus of Agapanthus praecox to enrich the molecular biology theory. 【Method】iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantification） technology was performed to identify DEPs in the four key steps of cryopreservation（preculture，vitrification dehydration，dilution，recovery） of the embryogenic callus of A. praecox，bioinformatics analysis method was used to construct the protein regulatory network in response to complex stress during cryopreservation and select stressed-protected proteins in plants. 【Result】A total of 2730 proteins were identified，of which 821 DEPs were selected. GO annotation analysis showed that these DEPs were mainly involved in biological process such as metabolic process，cellular process and responses to stimulus，while catalytic activity and molecular binding were the most important parts of molecular function. KEGG pathway analysis indicated that DEPs were mainly enriched in energy metabolism，protein synthesis and degradation，signal transduction and membrane repair. The DEPs interaction regulatory network was constructed by STRING software，it was found that up-regulated DEPs were mainly involved in carbohydrate metabolism，oxidation-reductive process and ribosome translation，while down-regulated DEPs were mainly involved in ROS metabolism，DNA repair，inhibition of programmed cell death（PCD） process and cytoskeleton. In addition，96 DEPs related to stress protection were detected for energy metabolism，redox homeostasis，protein synthesis and degradation and signal transduction. 【Conclusion】Energy metabolism，oxidative stress，protein degradation and PCD events of embryogenic callus of A. praecox increase during cryopreservation;while the ROS clearance and stress defense process of cells decrease greatly. Embryogenic callus of A. praecox form resistance protection mechanism with glycometabolism and antioxidant system as the majority under cryopreservation compound stress.

Key words： Agapanthus praecox; embryogenic callus; proteomics; cryopreservation; differentially expressed protein

0 引言

【研究意義】百子蓮（Agapanthus praecox）為百子蓮科百子蓮屬植物，源于非洲南部，為多年生草本花卉。作為優(yōu)良種質(zhì)資源，百子蓮于2003年首次被引入我國(guó)，但由于夏季高溫高濕氣候條件的影響，其胚胎敗育率較高，不利于其推廣應(yīng)用。通過(guò)建立百子蓮組織培養(yǎng)與體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，可實(shí)現(xiàn)百子蓮優(yōu)良品種的無(wú)性快繁（李曉丹，2013）。體胚技術(shù)誘導(dǎo)的胚性愈傷組織（Embryogenic callus，EC）是植物離體快繁、分子育種及資源保存的重要材料，但長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)會(huì)使細(xì)胞的胚性逐漸退化甚至喪失，利用玻璃化法超低溫保存是實(shí)現(xiàn)百子蓮種質(zhì)資源離體保存的重要途徑。玻璃化法超低溫保存是先將材料放置于由高濃度滲透和非滲透性保護(hù)劑組成的玻璃化溶液（Plant vitrification solution，PVS）中，使細(xì)胞在快速降溫過(guò)程中被固化成玻璃化態(tài)，以降低胞內(nèi)致命冰晶的產(chǎn)生，最終在低溫條件下實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存（任麗，2014）。然而，植物材料在保存過(guò)程中也面臨嚴(yán)重脫水、低溫和機(jī)械損傷等復(fù)合脅迫，引起胞內(nèi)活性氧（ROS）失衡、質(zhì)膜過(guò)氧化、蛋白變性及離子毒害等脅迫傷害（任麗，2014）。降低超低溫保存過(guò)程中的細(xì)胞脅迫傷害可有效提高植物超低溫保存效率。因此，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示植物胚性細(xì)胞在超低溫保存過(guò)程中的應(yīng)答與保護(hù)機(jī)制，可為補(bǔ)充完善植物超低溫保存的逆境生理理論提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人已在百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存的逆境生理方面開(kāi)展了相關(guān)研究工作。陳冠群（2014）以添加適當(dāng)濃度外源抗氧化物的方式優(yōu)化了百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存體系;何廣深等（2014）探究了超低溫保存過(guò)程中百子蓮胚性愈傷組織Ca2+分布情況及濃度變化對(duì)細(xì)胞適應(yīng)能力的影響，發(fā)現(xiàn)Ca2+主要分布在細(xì)胞代謝活動(dòng)旺盛的區(qū)域，且在細(xì)胞抗氧化過(guò)程中發(fā)揮重要作用;Zhang等（2015）揭示了ROS介導(dǎo)的氧化脅迫和細(xì)胞凋亡事件是直接影響超低溫保存過(guò)程中百子蓮胚性細(xì)胞活性的兩個(gè)關(guān)鍵因素，其中H2O2是引起氧化損傷最主要的ROS分子。近年來(lái)，以RNA-seq和雙向凝膠電泳為主的組學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用于一些農(nóng)林作物和模式植物的超低溫保存研究領(lǐng)域。Carpenier等（2007）利用雙向電泳技術(shù)檢測(cè)香蕉分生組織在凍存過(guò)程中蛋白的差異表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)一些參與能量代謝和細(xì)胞防御、死亡及衰老過(guò)程的蛋白上調(diào)表達(dá)，而參與蛋白合成與細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的蛋白下調(diào)表達(dá);Forni等（2010）在低溫凍存的蘋果莖尖組織中發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞周期減緩和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的重要蛋白;Ren等（2013，2015）研究發(fā)現(xiàn)，由于冷凍保護(hù)劑處理導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化是影響擬南芥低溫保存成活率的重要原因，隨后又從轉(zhuǎn)錄水平揭示calcium-binding protein、OXI1、WRKY及MYB家族成員作為ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，對(duì)ROS的產(chǎn)生和清除發(fā)揮了重要作用; Folgado等（2014）在馬鈴薯莖尖組織的凍存研究中發(fā)現(xiàn)氧化還原平衡、碳代謝和蛋白修復(fù)過(guò)程增強(qiáng)，并證實(shí)糖類和參與氧化還原過(guò)程的蛋白對(duì)植物細(xì)胞在冷凍保存過(guò)程中的耐受性和適應(yīng)性起重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究主要集中在百子蓮胚性愈傷組織的超低溫保存體系優(yōu)化和逆境生理方面，但缺乏從蛋白質(zhì)組學(xué)層面對(duì)其分子調(diào)控機(jī)制和蛋白保護(hù)功能進(jìn)行深入探究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)研究百子蓮胚性愈傷組織在超低溫保存過(guò)程中蛋白的表達(dá)情況，從蛋白質(zhì)組學(xué)層面揭示植物胚性細(xì)胞對(duì)超低溫復(fù)合逆境的響應(yīng)調(diào)控機(jī)制，并篩選出具有重要保護(hù)作用的差異表達(dá)蛋白，以進(jìn)一步豐富觀賞植物超低溫保存的分子生物學(xué)理論。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為藍(lán)色大花百子蓮（A. praecox ssp. orientails）胚性愈傷組織，由上海交通大學(xué)幼苗實(shí)踐培訓(xùn)基地提供。

主要設(shè)備儀器：人工氣候箱（RXZ智能型，寧波江南儀器廠）、恒溫水浴鍋（DK-S22型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、LC-20AB液相色譜儀（島津，日本）和Q-EXACTIVE質(zhì)譜儀（ThermoFisher Scientific，美國(guó)）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 超低溫保存方法及取樣 百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存參照陳冠群（2014）的方法。主要步驟：（1）預(yù)培養(yǎng)：選取狀態(tài)良好的百子蓮胚性愈傷組織，放在含有0.5 mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃低溫下暗培養(yǎng)48 h。（2）裝載：將預(yù)培養(yǎng)后的百子蓮胚性愈傷組織加入含有裝載液（MS+2.0 mol/L 丙三醇+0.4 mol/L蔗糖+10.0 mmol/L KNO3）的凍存管中，室溫下處理60 min。（3）玻璃化溶液脫水處理：將裝載液處理后的百子蓮胚性愈傷組織移入含有玻璃化保護(hù)液PVS2（MS液體培養(yǎng)基+15% DMSO+15%乙二醇+30%丙三醇+0.4 mol/L蔗糖）的凍存管中，在0 ℃下脫水處理50 min。（4）快速冷凍與解凍：液氮凍存1 h后，將放有百子蓮胚性愈傷組織的凍存管于40 ℃條件下水浴解凍90 s。（5）洗滌：在室溫下使用洗滌液（MS液體培養(yǎng)基+10.0 mmol/L KNO3+1.2 mol/L蔗糖）每間隔10 min對(duì)百子蓮胚性愈傷組織洗滌一次，重復(fù)3次。（6）恢復(fù)培養(yǎng)：將洗滌過(guò)后的百子蓮胚性愈傷組織放在MS固體培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)24 h。取上述預(yù)培養(yǎng)、玻璃化溶液脫水處理、洗滌及恢復(fù)培養(yǎng)后的百子蓮胚性愈傷組織為試驗(yàn)組樣品，以未經(jīng)處理的百子蓮胚性愈傷組織為對(duì)照組樣品。

1. 2. 2 蛋白提取與測(cè)定 分別稱取1 g對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品，在液氮中充分研磨成粉末，加入適量蛋白裂解溶液溶解，分別添加終濃度為1 mmol/L的PMSF和2 mmol/L的EDTA，5 min后添加終濃度10 mmol/L的DTT;超聲溶解15 min后，25000×g離心20 min取上清液;加入5倍體積預(yù)冷丙酮，在-20 ℃沉淀2 h，1600×g離心20 min，收集沉淀;加入適量蛋白裂解溶解液，分別添加終濃度為1 mmol/L的PMSF和2 mmol/L的EDTA，5 min后添加終濃度10 mmol/L的DTT;超聲溶解15 min后，25000×g離心20 min取上清;上清液加入DTT至終濃度10 mmol/L，56 ℃水浴1 h;取出后迅速加入IAM至終濃度55 mmol/L，暗室靜置45 min;混合樣品后再次加入5倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃沉淀2 h;隨后25000×g離心20 min取沉淀;沉淀在200 μL 0.5 mol/L TEAB中超聲溶解15 min后，25000×g離心20 min后取上清液。利用Brandford法測(cè)定蛋白濃度。

1. 2. 3 蛋白酶解與iTRAQ標(biāo)記 提取后的各樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析檢測(cè)后，精確稱取100 μg蛋白按蛋白與酶20∶1的比例加入Tryspin，在37 ℃下酶解2 h，然后按上述比例補(bǔ)加Tryspin再酶解8 h。真空離心泵抽干肽段后，用0.5 mol/L TEAB復(fù)溶肽段，利用分子質(zhì)量為114、116、118、119和121的基團(tuán)依次標(biāo)記對(duì)照組與試驗(yàn)組（預(yù)培養(yǎng)、玻璃化脫水、洗滌及恢復(fù)培養(yǎng)）蛋白，室溫培養(yǎng)2 h。

1. 2. 4 肽段分離與蛋白鑒定 將標(biāo)記好的各組肽段等量混合后，采用島津LC-20 AB系統(tǒng)對(duì)樣品液相分離，分離后的肽段進(jìn)入到串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀Q-EXACTIVE（ThermoFisher Scientific，San Jose，CA），進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1. 2. 5 數(shù)據(jù)處理 利用Mascot（2.3.02）將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)與已建立的百子蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra，登錄號(hào)：SRR850813）搜索匹配?；跀?shù)據(jù)庫(kù)搜索策略的肽段質(zhì)量誤差為20 ppm，且蛋白至少含一個(gè)特異性肽段，被認(rèn)為鑒定有效。

1. 2. 6 生物信息學(xué)分析 以差異表達(dá)變化倍數(shù)上調(diào)或下調(diào)大于1.5倍，篩選出差異表達(dá)蛋白。鑒定到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO（Gene ontology）注釋，利用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)明確超低溫保存四個(gè)關(guān)鍵步驟的差異表達(dá)蛋白參與的顯著性富集通路;使用Genesis（1.8.1）對(duì)不同表達(dá)模式的差異蛋白進(jìn)行聚類，并以此為基礎(chǔ)在STRING網(wǎng)站（https：//string-db.org）上構(gòu)建上下調(diào)差異表達(dá)蛋白的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 iTRAQ分析與差異蛋白篩選結(jié)果

對(duì)5個(gè)測(cè)試的百子蓮胚性愈傷組織樣品進(jìn)行蛋白iTRAQ定量分析，共識(shí)別獲得349591張二級(jí)譜圖，其中有42008張譜圖與已知譜圖匹配，含有特異性肽段的質(zhì)譜圖數(shù)為37718張;共鑒定到肽段8466條，特有肽段7941條，蛋白2730種（表1）。在全蛋白的基礎(chǔ)上篩選出變化倍數(shù)大于1.5倍的作為差異表達(dá)蛋白（表2），與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，在預(yù)培養(yǎng)、玻璃化脫水、洗滌和恢復(fù)培養(yǎng)階段的差異表達(dá)蛋白數(shù)量依次為383、257、485和448個(gè)，四個(gè)階段樣品合計(jì)共有821個(gè)差異表達(dá)蛋白。

2. 2 差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋分析結(jié)果

對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能注釋，以確定其主要行使的生物學(xué)功能。結(jié)果共有682個(gè)差異表達(dá)蛋白注釋到121個(gè)顯著性GO條目之中（圖1）。在細(xì)胞組分（Cell component）中，差異表達(dá)蛋白主要涉及細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞器（Organelle）和膜結(jié)構(gòu)（Membrane）等，分別占注釋差異表達(dá)蛋白的79.6%、59.4%和35.8%;在分子功能（Molecular function）中，差異表達(dá)蛋白在催化活性（Catalytic activity）、分子結(jié)合（Binding）及結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)（Structural molecule acti-vity）上顯著富集，分別占注釋差異表達(dá)蛋白的59.5%、52.1%和5.4%;而在生物學(xué)過(guò)程（Biology process）中，差異表達(dá)蛋白主要參與了代謝過(guò)程（Metabolic process）、細(xì)胞過(guò)程（Cellular process）和刺激應(yīng)答（Response to stimulus），分別占注釋差異表達(dá)蛋白的65.0%、58.4%和36.8%。由此可見(jiàn)，超低溫保存中百子蓮胚性愈傷組織的刺激應(yīng)答和代謝過(guò)程具有明顯變化，并對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。

2. 3 差異表達(dá)蛋白Pathway注釋結(jié)果

為深入了解超低溫保存過(guò)程中差異表達(dá)蛋白參與的代謝通路，用散點(diǎn)圖展示KEGG顯著富集的前20條Pathway（圖2）。在預(yù)培養(yǎng)階段（圖2-A），差異表達(dá)蛋白主要富集在代謝（Metabolic pathways）和次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）通路;在脫水階段（圖2-B），差異表達(dá)蛋白主要參與植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）和一些氨基酸的代謝活動(dòng)（Alanine，aspartate and glutamate metabolism）;洗滌階段（圖2-C）的差異表達(dá)蛋白富集通路明顯增多，且以糖代謝為主，主要作用于剪接體（Spliceosome）、鞘脂代謝（Sphingolipid metabolism）、鞘糖脂生物合成（Glycosphingolipid biosynthesis）、糖胺聚糖降解（Glycosaminoglycan degradation）和半乳糖代謝（Galactose metabolism）等;在最終恢復(fù)培養(yǎng)過(guò)程中（圖2-D），顯著富集的通路分別是淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）及色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）等。由此可見(jiàn)，糖代謝與氨基酸代謝對(duì)超低溫保存具有積極的響應(yīng)，在維持細(xì)胞的基礎(chǔ)生理功能，植物激素信號(hào)在脫水保護(hù)與凍存過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

2. 4 差異表達(dá)蛋白的表達(dá)模式分析結(jié)果

對(duì)所有差異表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類，以蛋白變化倍數(shù)的log2值繪制聚類分析熱圖，差異表達(dá)蛋白的表達(dá)模式共分為六組聚類（圖3），其中A組含有96個(gè)蛋白，B組含有29個(gè)蛋白，C組含有259個(gè)蛋白，D組含有104個(gè)蛋白，E組含有221個(gè)蛋白，F(xiàn)組含有112個(gè)蛋白。從總體變化趨勢(shì)來(lái)看，A和C兩組差異表達(dá)蛋白的趨勢(shì)相似，在超低溫四個(gè)階段中呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，而B(niǎo)、E和F三組差異表達(dá)蛋白表達(dá)趨勢(shì)均下調(diào)，D組蛋白的表達(dá)水平隨超低溫處理過(guò)程呈波動(dòng)性變化。

根據(jù)聚類分析結(jié)果，將差異表達(dá)蛋白分為上調(diào)表達(dá)組（A和C組）和下調(diào)表達(dá)組（B、E和F組），分別含有355和362個(gè)蛋白。經(jīng)STRING在線軟件分析蛋白的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中上調(diào)表達(dá)組中有187個(gè)蛋白存在相互調(diào)控作用（圖4），主要參與淀粉和蔗糖的代謝（Starch and sucrose metabolism）、糖酵解與糖異生（Glycolysis/gluconeogenesis）、三羧酸循環(huán)（TCA-cycle）、氧化還原過(guò)程（Oxidation-reductive process）和核糖體翻譯（Ribosome & translation）等，說(shuō)明在超低溫保存過(guò)程中糖的代謝、氧化還原平衡及蛋白質(zhì)加工修飾過(guò)程增強(qiáng);下調(diào)表達(dá)組有249個(gè)蛋白構(gòu)成互作網(wǎng)絡(luò)（圖5），主要包括ROS代謝（ROS metabolism）、抵御氧化脅迫（Against oxidative damage）、細(xì)胞骨架（Cytoskeleton）、結(jié)構(gòu)分子活性（Structural molecule activity）、DNA修復(fù)和抑制PCD過(guò)程（Inhi-biting PCD）等過(guò)程。由此看出，在超低溫保存過(guò)程中百子蓮胚性愈傷組織的氧化應(yīng)激、脅迫傷害、質(zhì)膜受損及PCD過(guò)程有所加劇。

2. 5 響應(yīng)超低溫復(fù)合逆境脅迫的差異表達(dá)蛋白

綜合鑒定差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋、KEGG代謝通路及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選得到4類與超低溫復(fù)合逆境相關(guān)的96個(gè)蛋白（表3），分別參與能量代謝（Energy metabolism，44個(gè)）、氧化還原平衡（Redox homeostasis，18個(gè)）、蛋白質(zhì)合成與降解（Protein synthesis and degradation，17個(gè)）及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程（Si-gnal transduction，17個(gè)）。

3 討論

3. 1 能量代謝相關(guān)蛋白

糖代謝是細(xì)胞產(chǎn)生和獲取能量的主要方式，在植物抵御非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)大量與糖代謝相關(guān)的上調(diào)表達(dá)蛋白，包括參與糖酵解過(guò)程的磷酸丙糖異構(gòu)酶、6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和葡糖磷酸酶，參與TCA循環(huán)的琥珀酰-CoA合成酶、蘋果酸合成酶、酮戊二酸脫氫酶及參與磷酸戊糖途徑的轉(zhuǎn)酮醇酶等，其中以參與糖酵解活動(dòng)的差異表達(dá)蛋白居多，說(shuō)明百子蓮愈傷組織在超低溫保存過(guò)程中主要依賴糖酵解途徑產(chǎn)生更多的能量以維持細(xì)胞在脅迫環(huán)境下正常的生理機(jī)能。另外，蔗糖積累也是一種植物對(duì)逆境響應(yīng)常見(jiàn)的保護(hù)性反饋方式，在香蕉分生組織及馬鈴薯莖尖組織的低溫凍存中均發(fā)現(xiàn)蔗糖含量升高現(xiàn)象（Carpenier et al.，2007;Folgado et al.，2014）。本研究中發(fā)現(xiàn)一類上調(diào)表達(dá)的蔗糖合成酶，可促進(jìn)細(xì)胞在逆境脅迫下蔗糖的積累，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓水平和維持細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整性起保護(hù)作用。

3. 2 氧化還原平衡相關(guān)蛋白

在逆境脅迫下細(xì)胞體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，不斷積累導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及重要蛋白造成不可逆的傷害（Mittler et al.，2004）。植物自身存在一套完整的抗氧化系統(tǒng)，以維持細(xì)胞體內(nèi)的ROS平衡。前期對(duì)百子蓮超低溫保存的逆境生理研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量ROS誘導(dǎo)的氧化脅迫傷害是影響細(xì)胞功能活性的關(guān)鍵因素之一（陳冠群，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)2種超氧化物歧化酶和3種過(guò)氧化物酶呈下調(diào)表達(dá)，L-抗壞血酸過(guò)氧化物酶3和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶2顯著上調(diào)表達(dá)，前幾類下調(diào)表達(dá)蛋白主要參與抗氧化系統(tǒng)的酶促反應(yīng)，而后兩類上調(diào)表達(dá)蛋白主要參與谷胱甘肽和抗壞血酸等非酶促抗氧化過(guò)程。通過(guò)這些差異蛋白的表達(dá)變化判斷，在超低溫保存過(guò)程中非酶促抗氧化過(guò)程對(duì)于清除過(guò)量的ROS、緩解細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)發(fā)揮了重要作用，而高濃度冷凍保護(hù)劑可能使得胞內(nèi)蛋白酶活性下降，進(jìn)而影響酶促反應(yīng)的程度。此外，二硫鍵的氧化還原狀態(tài)對(duì)維持蛋白的正確折疊及高級(jí)結(jié)構(gòu)具有重要作用，過(guò)量的ROS會(huì)影響蛋白間二硫鍵的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)改變與失活（王秋霞，2008）。硫氧還蛋白（Thioredoxin，TRX）含有具氧化還原活性的二硫鍵，可通過(guò)硫醇—二硫鍵的可逆轉(zhuǎn)換對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧化還原調(diào)節(jié)，穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)與功能（張亞芳，2011）。本研究還發(fā)現(xiàn)一類H型TRX，在超低溫保存的四個(gè)階段均上調(diào)表達(dá)，對(duì)超低溫復(fù)合逆境中胞內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)與酶活性起重要的保護(hù)和調(diào)控作用。

3. 3 蛋白合成與降解相關(guān)蛋白

熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）是一類重要的抗逆保護(hù)蛋白，具有分子伴侶的特性，主要通過(guò)蛋白的合成與降解、穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位等多種生物學(xué)過(guò)程來(lái)維持植物體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)（栗振義等，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)1種上調(diào)表達(dá)和2種下調(diào)表達(dá)的HSP，表明不同類型的HSP以多種功能形式參與植物細(xì)胞的復(fù)合逆境響應(yīng)。60S核糖體蛋白參與蛋白的翻譯與合成，本研究發(fā)現(xiàn)四類60S核糖體蛋白呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，說(shuō)明蛋白的合成活動(dòng)在超低溫保存過(guò)程中受到一定影響;二硫鍵異構(gòu)酶和肽?！滨ｍ?lè)词疆悩?gòu)酶在細(xì)胞內(nèi)參與蛋白的折疊、裝配及運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過(guò)程（Price et al.，1994），本研究還發(fā)現(xiàn)二硫鍵異構(gòu)酶2前體和2種肽酰—脯氨酰順?lè)词疆悩?gòu)酶均呈下調(diào)表達(dá)，表明超低溫復(fù)合逆境脅迫對(duì)胞內(nèi)蛋白正常的加工與修飾過(guò)程具有一定阻礙作用，降低了蛋白的功能活性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。前期對(duì)百子蓮胚性愈傷組織的超低溫保存研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫與細(xì)胞程序性死亡（PCD）是影響細(xì)胞超低溫保存凍后活性的主要因素（Zhang et al.，2015）。半胱氨酸蛋白酶是一類與植物PCD密切相關(guān)的蛋白酶，在番茄、擬南芥和百日菊中參與受損細(xì)胞降解與清除的PCD過(guò)程（史剛榮，2002）;煙草天冬氨酸蛋白酶是在非生物脅迫下誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生PCD所必須的蛋白（Chichkova et al.，2010;Vartapetian et al.，2011），枯草桿菌酶的蛋白前體也表現(xiàn)出類半胱天冬酶的活性，同樣參與植物的PCD過(guò)程（Hatsugai et al.，2009;Tran et al.，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)這幾類重要的蛋白酶多在玻璃化脫水及恢復(fù)培養(yǎng)階段上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其參與了由高濃度玻璃化溶液及超低溫凍后環(huán)境引起的PCD下游蛋白降解過(guò)程。

3. 4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白

鈣離子是植物體內(nèi)重要的第二信使，其濃度變化影響著細(xì)胞的代謝活動(dòng)（Bush et al.，1995）。在擬南芥中，鈣依賴蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPKs）和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（Calmodulin-binding protein，CaMBP）可顯著提高植物的抗逆性（Xu et al.，2011;Zhao et al.，2013）。在擬南芥幼苗超低溫保存的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，鈣結(jié)合基因calcium-binding protein表達(dá)量顯著上調(diào)，是ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和清除網(wǎng)絡(luò)的重要因子（Ren et al.，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)4種CDPKs和CaMBP在蛋白質(zhì)組學(xué)層面均呈下調(diào)表達(dá)，可能源于植物幼苗與胚性愈傷材料在超低溫復(fù)合逆境下具有不同的應(yīng)激響應(yīng)模式，或CDPKs和CaMBP在超低溫復(fù)合逆境的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與蛋白表達(dá)水平上存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。磷酸酶和蛋白激酶作為胞內(nèi)信號(hào)分子可通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化程度控制其他酶類或蛋白質(zhì)的活性，影響細(xì)胞的代謝活動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)多種類受體蛋白激酶和磷酸酶下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明在超低溫保存過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)通過(guò)磷酸化和去磷酸化的信號(hào)調(diào)控方式受到抑制。14-3-3蛋白是一類高度保守的逆境信號(hào)響應(yīng)蛋白（Oecking and Jaspert，2009），在脅迫條件下的甜菜、番茄和柑橘等植物中參與調(diào)節(jié)離子通道和酶活性（Robert et al.，2002;肖強(qiáng)和鄭海雷，2005;Denison et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)2種上調(diào)表達(dá)的14-3-3蛋白，推測(cè)其在超低溫過(guò)程中通過(guò)參與調(diào)節(jié)離子通道的活性和數(shù)量，從而維持細(xì)胞滲透壓水平，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。肌醇單磷酸酶（Inositol monophosphatase，IMP）是磷酸肌醇信號(hào)通道的關(guān)鍵酶，在鷹嘴豆（Saxena et al.，2013）、南瓜（王安君等，2016）等植物中發(fā)現(xiàn)其在抵抗非生物脅迫和病害方面發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)1種肌醇單磷酸酶3在超低溫過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明其可能通過(guò)調(diào)節(jié)肌醇的代謝水平對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要的滲透保護(hù)作用。

4 結(jié)論

在百子蓮超低溫保存過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)能量代謝、氧化應(yīng)激及PCD有所加劇，ROS清除和脅迫防御活動(dòng)明顯減弱，百子蓮胚性愈傷組織在超低溫復(fù)合逆境下形成以糖代謝和抗氧化系統(tǒng)為主的抗逆保護(hù)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

陳冠群. 2014. 基于擬南芥抗氧化機(jī)制優(yōu)化百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存體系[D]. 上海：上海交通大學(xué). [Chen G Q. 2014. Optimization of Agapanthus embryogenic callus cryopreservation based on the Arabidopsis antioxidant mechanism[D]. Shanghai：Shanghai Jiaotong University.]

何廣深，張荻，申曉輝. 2014. 百子蓮胚性愈傷組織在玻璃化法超低溫保存4個(gè)關(guān)鍵步驟中Ca2+的分布變化[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），32（6）：14-22. [He G S，Zhang D，Shen X H. 2014. Distribution change of Ca2+ in embryogenic callus of Arabidopsis praecox during the 4 key steps of vitrification cryopreservation[J]. Journal of Shanghai Jiaotong University（Agricultural Science），32（6）：14-22.]

李曉丹. 2013. 百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存技術(shù)的研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué). [Li X D. 2013. Vitrification cryopreservation of embryonic callus of Agapanthus praecox[D]. Harbin：Northeast Forest University.]

栗振義，龍瑞才，張鐵軍，楊青川，康俊梅. 2016. 植物熱激蛋白研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，32（2）：7-13. [Li Z Y，Long R C，Zhang T J，Yang Q C，Kang J M. 2016. Research progress on plant heat shock protein[J]. Biotechnology Bu-lletin，32（2）：7-13.]

任麗. 2014. 擬南芥幼苗對(duì)玻璃化法超低溫保存的逆境響應(yīng)機(jī)制[D]. 上海：上海交通大學(xué). [Ren L. 2014. The regulatory mechanism of Arabidopsis seedlings response to stress from vitrification-based cryopreservation[D]. Shanghai：Shanghai Jiaotong University.]

史剛榮. 2002. 植物細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)和調(diào)控[J]. 生物學(xué)教學(xué)，27（12）：8-9. [Shi G R. 2002. Induction and regulation of programmed cell death in plants[J]. Biology Teac-hing，27（12）：8-9.]

王安君，李玉丹，黃河勛，羅少波，吳廷全，李任強(qiáng)，鐘玉娟. 2016. 南瓜肌醇單磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，43（7）：1315-1325. [Wang A J，Li Y D，Huang H X，Luo S B，Wu T Q，Li R Q，Zhong Y J. 2016. Cloning and characterization of two genes encoding myo-inositol monophosphatase 1（CmIMP1）and 2（CmIMP2）from pumpkin[J]. Acta Horticulturae Sinica，43（7）：1315-1325.]

王秋霞. 2008. 鹽芥和擬南芥硫氧還蛋白在氧化脅迫中的功能研究[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué). [Wang Q X. 2008. The functional research of Thellungiella halophila TRXh and Arbidopsis thaliana TRXh[D]. Jinan：Shandong Normal University.]

肖強(qiáng)，鄭海雷. 2005. 14-3-3蛋白與植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，27（4）：417-422. [Xiao Q，Zheng H L. 2005. The 14-3-3 proteins and plant signal transduction[J]. Chinese Journal of Cell Biology，27（4）：417-422.]

張亞芳. 2011. 水稻硫氧還蛋白OsTRXh1結(jié)合蛋白的鑒定及功能研究[D]. 石家莊：河北師范大學(xué). [Zhang Y F. 2011. Identification and functional analysis of rice thioredoxin OsTRXh1 interaction proteins[D]. Shijiazhuang：Hebei Normal University.]

Bush D S. 1995. Calcium regulation in plant cells and its role in signaling[J]. Annual Review of Plant Biology & Plant Molecular Biology，46：95-122.

Carpentier S C，Witters E，Laukens K，van Onckelen H，Swennen R，Panis B. 2007. Banana.（Musa spp.） as a model to study the meristem proteome：Acclimation to osmotic stress[J]. Proteomics，7（1）：92-105.

Chichkova N V，Shaw J，Galiullina R A，Drury G E，Tuzhikov A I，Kim S H，Kalkum M，Hong T B，Gorshkova E N，Torrance L，Vartapetian A B，Taliansky M. 2010. Phytaspase，a relocalisable cell death promoting plant protease with caspase specificity[J]. The EMBO Journal，29（6）：1149-1161.

Denison F C，Paul A L，Zupanska A K，F(xiàn)erl R J. 2011. 14-3-3 proteins in plant physiology[J]. Seminars in Cell & Development Biology，22（7）：720-727.

Folgado R，Sergeant K，Renaut J，Swennen R，Hausman J F，Panis B. 2014. Changes in sugar content and proteome of potato in response to cold and dehydration stress and their implications for cryopreservation[J]. Journal of Proteomics，98（4）：99-111.

Forni C，Braglia R，Beninati S，Lentini A，Ronci M，Urbani A，Provenzano B，F(xiàn)rattarelli A，Tabolacci C，Damiano C. 2010. Polyamine concentration，transglutaminase activity and changes in protein synthesis during cryopreservation of shoot tips of apple variety annurca[J]. Cryo Letters，31（5）：413-425.

Hatsugai N，Iwasaki S，Tamura K，Kondo M，F(xiàn)uji K，Ogasa-wara K，Nishimura M，Hara N I. 2009. A novel membrane fusion-mediated plant immunity against bacterial pathogens[J]. Genes & Development，23（21）：2496-2506.

Mittler R，Vanderauwera S，Gollery M，Breusegem F V. 2004. Reactive oxygen gene network of plants[J]. Trends in Plant Science，9（10）：490-498.

Oecking C，Jaspert N. 2009. Plant 14-3-3 proteins catch up with their mammalian orthologs[J]. Current Opinion in Plant Biology，12（6）：760-765.

Price E R，Jin M，Lim D，Pati S，Walsh C T，Mckeon F D. 1994. Cyclophilin B trafficking through the secretory pathway is altered by binding of cyclosporin A[J]. Procee-dings of the National Academy of Sciences，91（9）：3931-3935.

Ren L，Zhang D，Jiang X N，Gai Y，Wang M W，Reed B M，Shen X H. 2013. Peroxidation due to cryoprotectant treatment is a vital factor for cell survival in Arabidopsis cryopreservation[J]. Plant Science，212：37-47.

Ren L，Zhang D，Chen G Q，Reed B M，Shen X H，Chen H Y. 2015. Transcriptomic profiling revealed the regulatory mechanism of Arabidopsis seedlings response to oxidative stress from cryopreservation[J]. Plant Cell Reports，34（12）：2161-2178.

Robert M R，Salinas J，Collinge D B. 2002. 14-3-3 proteins and the response to abiotic and biotic stress[J]. Plant Molecular Biology，50（6）：1031-1039.

Saxena S C，Salvi P，Kaur H，Verma P，Petla B P，Rao V，Kamble N，Majee M. 2013. Differentially expressed myo-inositol monophosphatase gene（CaIMP） in chickpea（Cicer arietinum L.） encodes a lithium-sensitive phosphatase enzyme with broad substrate specificity and improves seed germination and seedling growth under abiotic stresses[J]. Journal of Experimental Botany，64（18）：5623-5639.

Tran V，Weier D，Radchuk R，Thiel J，Radchuk V. 2014. Caspase-like activities accompany programmed cell death events in developing barley grains[J]. PLoS One，9（10）：e109426.

Vartapetian A B，Tuzhikov A I，Chichkova N V，Taliansky M，Wolpert T J. 2011. A plant alternative to animal caspases：Subtilisin-like proteases[J]. Cell Death & Differentiation，18（8）：1289-1297.

Xu G Y，Rocha P S，Wang M L，Xu M L，Cui Y C，Zhu Y X，Xia X . 2011. A novel rice calmodulin-like gene，OsMSR2，enhances drought and salt tolerance and increases ABA sensitivity in Arabidopsis[J]. Planta，234（1）：47-59.

Zhang D，Ren L，Chen G Q，Zhang J，Reed B M，Shen X H. 2015. ROS-induced oxidative stress and apoptosis-like event directly affect the cell viability of cryopreserved embryogenic callus in Agapanthus praecox[J]. Plant Cell Reports，34（9）：1499-1513.

Zhao Q，Zhang H，Wang T，Chen S X，Dai S J. 2013. Proteomics-based investigation of salt-responsive mechanisms in plant roots[J]. Journal of Proteomics，82：230-253.

（責(zé)任編輯 王 暉）