閆成光 張渝潔 唐瑋琦 邢晉祎

摘要：【目的】分析骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）基因在雞胚不同發(fā)育階段的表達水平，為進一步研究BMPs基因的功能提供依據(jù)?！痉椒ā窟x取AA肉雞種蛋100枚進行孵化，分別于孵化期第1、2、3、4、5、6、9、12、15、18d（記為E1～E18）選取胚蛋6枚，E1～E6采集整胚，E12～E18分別采集大腦、心臟、肝臟和腿肌組織。采用定量PCR（qPCR）方法檢測BMP2、BMP4和BMP7基因的表達豐度。【結(jié)果】BMP2基因在E1～E6中的表達水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;BMP2在E4、E5和E6中的表達水平顯著高于E1（P<0.05）;BMP2在大腦中的表達顯示，E12顯著高于E1（P<0.05），而到了E18階段反而極顯著低于E1（P<0.01）;BMP2在心臟和腿肌中的表達均是E9顯著或極顯著大于E1（P<0.05或尸<0.01）;雞胚發(fā)育到了后期（E15和E18），BMP2在心臟和肝臟中的表達卻顯著或極顯著低于E1時期（P<0.05或P<0.01）。BMP4在E1-E6中的表達水平也是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;BMP4基因在E3～E6整胚和E9胚齡的大腦、心臟、肝臟和腿肌中的表達水平均顯著或極顯著高于E1胚齡（P<0.05或尸<0.01）。BMP7在E4、E5和E6的表達與BMP2、BMP李類似，即BMP7基因的表達水平顯著或極顯著高于E1時期（P<0.05或P<0.01），但在E2和E3時期，BMP7表達水平反而降低了，且E2時期極顯著低于E1時期（P<0.01）;在整胚和大腦中的結(jié)果顯示，E4～E18階段BMP7基因的表達水平呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，到E18時期大腦中的BMP7基因的表達水平極顯著低于E1時期（P<0.01）;與E1相比，在心臟中BMP7到E12時期達到最低水平（P<0.01），而肝臟中BMP7基因表達水平在E12和E15階段均極顯著低于E1（P<0.01）?！窘Y(jié)論】BMP2、BMP4和BMP夕基因在整胚的表達水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，至E4時期到達最高點;BMP2基因在E9、E12、E15和E18的心臟、肝臟和腿肌中的表達均呈現(xiàn)下降趨勢。說明BMPs基因在器官形成初期起著關(guān)鍵作用，之后隨著器官發(fā)育完成BMPs基因的作用逐漸減弱。

關(guān)鍵詞：肉雞;骨形成蛋白;雞胚;表達水平

中圖分類號：S814.6 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）11-1276-07

0 引言

【研究意義】胚胎期是動物生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，此時機體生長發(fā)育的狀況對動物出生后的各項性能具有極其重要的影響。由于雞胚具有發(fā)育周期短、易于操作等特點，所以雞胚成為研究胚胎發(fā)育和器官形成機制的最佳模型[1]。另外，雞胚發(fā)育過程受到多種基因嚴格調(diào)控，保證胚胎有序地進行組織分化和個體發(fā)育。大腦、心臟和肝臟是雞胚發(fā)育過程中較早發(fā)育的重要器官。因此，以雞胚為試驗材料，研究骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）基因在雞胚中的表達規(guī)律，可為進一步研究BMPs基因的功能提供依據(jù)。[前人研究進展】BMPs蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）超家族的多功能生長因子，它能夠誘導動物或人體間充質(zhì)細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織[2-3];BMPs不但能促進骨骼形成并幫助修復骨折，而且可以通過抑制肌肉生成來指導體細胞的發(fā)育[3]。目前，BMPs在胚胎發(fā)育、動物出生后以及成年動物細胞功能中的作用越來越受到重視。最初，BMPs按照氨基酸序列及同源性分為BMP1～7種，但隨著研究的深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種BMPs[3-4]。已證明BMP2、4、6、7、9具有顯著的成骨特性[5-6]。BMP2在誘發(fā)軟骨及硬骨的生成、成骨細胞的分化扮演重要角色[7-9];BMP4可以調(diào)節(jié)牙齒、四肢以及由中胚層發(fā)育而來的硬骨形成，其對骨折的修復、上表皮的形成、腹背軸的形成，以及卵巢濾泡的發(fā)育過程發(fā)揮作用[3，10-11];BMP7主要在成骨細胞的分化、脂肪形成和能量消耗、腎的發(fā)育及修復中有重要作用[12-14]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，尚未見有BMP2、BMP4、BMP7基因在雞胚中定量表達研究的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文研究BMP2、BMP4、BMP7基因在雞胚不同發(fā)育階段的表達水平，以期為BMPs基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 雞胚孵化與樣品采集

選取新鮮的艾拔益加（Arbor Acres，AA）肉雞種蛋100枚（蛋重50～55g），洗凈，用高錳酸鉀熏蒸消毒后放入溫度為（37±0.5）℃、濕度為60%的孵化箱中孵化，每隔2h自動翻蛋1次。分別于孵化期第1、2、3、4、5、6、9、12、15、18d（記為E1、E2、E3、E4、E5、E6、E9、E12、E15、E18）同一時間選取大小一致、發(fā)育良好的胚蛋6枚，E1～E6采集整胚，E12～E18分別采集大腦、心臟、肝臟和左側(cè)大腿肌肉組織放入凍存管液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取與cDNA的合成

采用Trizol（Invitrogen公司）法從整胚、腦、心、肝和腿部肌肉中提取總RNA。用核酸蛋白檢測儀檢測總RNA的純度和濃度。利用M-MLV（Promega公司）反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，按照說明書合成cDNA第一鏈。

1.3 引物設計與熒光定量PCR擴增（qPCR）

根據(jù)GenBank上雞的BMP2（登錄號：NM_204358）、BMP4（登錄號：NM 205237）和BMP7（登錄號：AF205877）基因序列，利用Primer Premier6.0軟件設計qPCR引物。以雞GAPDH（登錄號：NM_204305）基因為內(nèi)參，引物序列由北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司合成（表1）。

采用SYBR Green I（Tiangen公司）染料法，以雞GAPDH基因為內(nèi)參，進行BMP2、BMP4和BMP7基因qPCR分析。qPCR反應組成：FastFire qPCR PreMix10μL，引物各0.2μL，cDNA（稀釋10倍）1μL，滅菌超純水加至20μL。qPCR反應程序：95℃5min;95℃20s，退火溫度（表1）10s，72℃1s，重復40個循環(huán)。每個循環(huán)后采集熒光生成擴增曲線。為了分析qPCR擴增的特異性，溫度從58℃緩慢升溫到95℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。所有樣本進行3個重復測定，并在每次試驗時設陰性對照。根據(jù)熒光曲線的Ct值及標準曲線，以雞GAPDH基因為內(nèi)參，用2^-△△Ct法計算BMP2、BMP4和BMP7基因mRNA的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計分析

BMP2、BMP4和BMP7基因的mRNA表達水平表示為平均值±標準差（SD）。利用SAS8.2軟件，采用單因子方差分析（One-way ANOVA）分析平均數(shù)間的差異顯著性。當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMP2基因的表達水平

以不同發(fā)育階段的雞胚cDNA為模板，進行BMP2基因qPCR擴增，試驗結(jié)果如圖1所示。從圖1可見，BMP2基因在整胚（E1～E6）中的表達水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢;與E1相比，BMP2基因在E4、E5和E6中的表達水平顯著增高（P<0.05）。BMP2在大腦中的表達顯示E12時期顯著高于E1時期（P<0.05），而到了E18階段反而極顯著低于E1階段（P<0.01）。BMP2在心臟和腿肌中的表達E9階段顯著或極顯著大于E1時期（P<0.05或P<0.01）;雞胚發(fā)育到了后期（E15和E18），BMP2基因在心臟和肝臟中的表達卻顯著或極顯著低于E1時期（P<0.05或P<0.01）。

2.2 BMP4基因的表達水平

BMP4基因表達水平如圖2所示。與BMP2類似，BMP4基因在整胚（E1～E6）中的表達水平也是呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢;與E1相比，BMP4基因在E3～E6整胚和E9胚齡的大腦、心臟、肝臟和腿肌中的表達水平均顯著或極顯著增加（P<0.05或P<0.01）;而在E2、E12、E15和E18胚齡時期，BMP4基因的表達與E1相比均未達到差異顯著水平（P>0.05）。

2.3 BMP7基因的表達水平

圖3為BMP7基因在雞胚中的表達水平。結(jié)果表明，E4、E5和E6時期BMP7基因表達與BMP2、BMP4類似，即BMP7基因的表達水平顯著或極顯著高于E1時期（P<0.05或P<0.01），但在E2和E3時期，BMP7基因表達水平降低，且E2時期極顯著低于E1時期（P<0.01）。在整胚和大腦中的結(jié)果顯示，從E4～E18階段BMP7基因的表達水平呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，到E18時期極顯著低于E1時期（P<0.01）。在心臟、肝臟和腿肌中也出現(xiàn)類似的情況。相較于E1，心臟部位的BMP7表達在E12階段達到最低水平（P<0.01），而肝臟中BMP7基因水平到E12和E巧階段均極顯著低于E1階段（P<0.01）。BMP7基因在其余組織和胚齡中的表達均未達到差異顯著水平（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

最近研究發(fā)現(xiàn)，BMPs不但具有促進骨生長和成骨細胞分化的特性，而且與細胞增殖以及分化、凋亡、形態(tài)發(fā)生時的細胞通訊等細胞發(fā)育過程有直接或間接關(guān)系[8-9，14]。本研究以不同發(fā)育階段雞胚為研究對象，應用qPCR方法分析了BMP2、BMP4、BMP7基因在整胚和肌肉、心臟、肝臟和大腦中的表達水平變化。結(jié)果表明，BMP2和BMP4在E1～E6中的表達均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢;BMP7基因在E4～E6中的表達呈現(xiàn)下降趨勢;BMP2、BMP4、BMP7基因在E9以后不同組織中表達水平呈現(xiàn)不同的變化趨勢;與E1相比，BMPs基因在E9～E18時期4種組織的表達量存在一定差異，反應了BMPs基因的表達有一定的時空規(guī)律性。值得注意的是，BMPs基因在整胚中的表達均在E4時到達最高點，推測這個時期BMPs基因的高表達可能對器官的形成起著重要作用，因為E4時期機體的器官均開始發(fā)育，胚胎頭部明顯增大，是器官形成的關(guān)鍵時期。另外，研究表明BMPs是雞胚前心外膜特性的重要調(diào)節(jié)因子，BMPs的時空表達模式對雞胚的心肌形成至關(guān)重要[15-16]，并且發(fā)現(xiàn)BMPs基因在雞胚頂外胚層嵴有較強的表達[17]。以上研究結(jié)果為進一步研究刀材凡基因的功能和信號傳導途徑提供了資料。

眾所周知，BMP2在骨折愈合中起著重要作用，BMP2基因的表達是啟動骨折愈合和調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的必要條件[18-19]，所以，BMP2是脊椎動物發(fā)育不可缺少的多功能調(diào)節(jié)器[2，20]。因此，BMP2在與骨形成、體內(nèi)平衡和再生相關(guān)的生物學過程中起著至關(guān)重要的作用Izl l在動物上的研究表明，BMP2基因在母羊卵巢中的表達增強可導致體外雌二醇濃度升高[22]，而BMP2基因在綿羊體內(nèi)的表達可抑制孕酮濃度[23];在雞的研究上也檢測到非閉鎖性竇狀卵泡膜和顆粒中BMP2的表達[24]。最近發(fā)現(xiàn)，BMP2基因在小尾寒羊下丘腦、輸卵管、卵巢、垂體和小腦中的相對表達高于蘇尼特羊[25]。本研究發(fā)現(xiàn)BMP2在E9～E18階段4種組織的表達除了在E12階段大腦組織有所上升外，BMP2在其余3種組織的表達均呈現(xiàn)下降趨勢。

BMP4不但在骨骼形成和骨折修復中發(fā)揮重要作用，而且與肌肉形成、卵母細胞成熟、卵泡發(fā)育和胚胎發(fā)育等密切相關(guān)[24，26-30]。據(jù)報道，BMP4在斑馬魚的嗅鞘、眼、囊泡、心臟、生殖管、肛門、腸道、胸鰭和尾鰭芽中表達[26]，而對鯉魚和羅非魚研究結(jié)果表明，BMP4基因在不同部位肌肉中的表達存在差異[29]對雞和鵝的研究發(fā)現(xiàn)，BMP4的相對豐度隨著卵泡發(fā)育過程不斷增加，在F5卵泡中達到最大值[28，30]。本研究中，BMP4在4種組織中的相對豐度均是在E9階段最高，在E12～E18階段均呈不規(guī)則的變化。

BMP7廣泛表達于人類胸腺、骨髓、脾臟、大腦、脊髓、心臟、骨骼肌、腎臟、肺、肝、胰腺和前列腺，對骨骼修復和再生、腎臟和眼睛形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用[31-32]。在綿羊上的研究發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊腦垂體、腦、下丘腦、輸卵管和卵巢中BMP7基因的表達明顯高于蘇尼特羊[24]。據(jù)報道，BMP7能誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化和解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）表達[33]。最近研究表明，刀幾護夕基因能調(diào)控雞卵巢功能和黑色素生成，對藍殼雞的雞冠色素沉著和產(chǎn)卵具有多效性[34]。本研究中，在雞胚E9～E18發(fā)育階段BMP7基因在大腦、心臟和肌肉中的表達量均是在E9階段最高，且在大腦中的表達呈現(xiàn)下降趨勢，在其他3種組織中均是不規(guī)則變化。

目前，對BMPs的研究越來越深入，一些新的功能也被發(fā)現(xiàn)。比如，BMP2和BMP4能促進白色脂肪發(fā)育，而BMP7與棕色脂肪發(fā)育有關(guān)[13，35]。不但BMP2能增加雌二醇的產(chǎn)生，提高卵巢顆粒細胞的存活率，而且BMP7也有同樣的功能[36]。另外，BMP2和BMP7可能還是影響綿羊產(chǎn)仔數(shù)的候選基因[37-38]。因此，隨著研究的不斷深入，BMPs的更多功能將被挖掘，為進一步改善動物遺傳性狀奠定基礎。

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（責任編輯：張梅）

收稿日期：2019-08-13初稿;2019-11-13修改稿

作者簡介：閆成光（1998-），男，主要從事動物分子遺傳研究（E-mail：2521131699@qq.com）

通信作者：邢晉祎（1968-），男，博士，教授，主要從事動物分子遺傳研究（E-mail：xingjinyi@lyu.edu.cn）

基金項目：國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201910452014）;山東省自然科學基金項目（ZR2017LC018）;國家自然科學基金項目（31372333）