陸承聰 李恒 張祥琴 王諒 陳藝欣 田厚軍 林碩 張潔 陳勇 魏輝

摘要：[目的]闡明幾丁質(zhì)合成通路中的關(guān)鍵基因UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDPN-acetylglucosaminepyrophosphorylases，UAP）對(duì)西花薊馬Frankliniella occidentalis生長(zhǎng)發(fā)育的影響。[方法]基于西花薊馬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆驗(yàn)證了UAP基因的開(kāi)放閱讀框（openReadingFrame，ORF）全長(zhǎng)序列，命名為FoccUAP。利用RT-qPCR方法分析FoccUAP在各個(gè)組織和不同齡期的表達(dá)情況。最后通過(guò)向西花薊馬蛻皮24h的2齡若蟲(chóng)顯微注射dsUAP，檢測(cè)沉默效率，觀察其對(duì)西花薊馬生長(zhǎng)發(fā)育的影響。[結(jié)果]FoccUAP基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1545bp，編碼514個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為56.738kDa，具有Glyoo-tmnf-GTA-typcSuperfamily家族的保守結(jié)構(gòu)域，與等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆蟲(chóng)的UAP基因親緣關(guān)系較近。FoccUAP基因在西花薊馬各個(gè)組織都有表達(dá)，在頭部和腹部相對(duì)表達(dá)量最高，觸角、胸部和足相對(duì)表達(dá)量較低。該基因在蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，其中2齡幼蟲(chóng)、蛹以及羽化后24、48、168、240h的成蟲(chóng)表達(dá)量分別是1齡幼蟲(chóng)的1.30、2.50、1.56、2.0、2.43和2.56倍。RNAi結(jié)果表明，注射dsUAP的西花薊馬羽化率（36.3%）和注射后120h的存活率（5.0%）均顯著低于dsGFP對(duì)照組，且注射dsUAP的西花薊馬成蟲(chóng)出現(xiàn)翅膀發(fā)育不完整、胸腹部皺縮不規(guī)則等畸形現(xiàn)象。[結(jié)論]FoccUAP基因?qū)ξ骰ㄋE馬生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用。

關(guān)鍵詞：西花薊馬;UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶;幾丁質(zhì)合成;RNAi

中圖分類(lèi)號(hào)：S435文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）12-1419-07

0 引言

[研究意義]西花薊馬Frankliniella occidentalis，屬于纓翅目Thysanoptera，薊馬科Thripidae，是全球性的重要害蟲(chóng)之一，主要通過(guò)直接取食以及間接傳播病毒病對(duì)250多種農(nóng)作物、花卉、蔬菜和樹(shù)木造成危害。2003年6月在我國(guó)大陸首次發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)，2004年后在北京和云南等地造成嚴(yán)重危害，是一種危險(xiǎn)性入侵生物。目前，國(guó)內(nèi)外主要采用化學(xué)藥劑來(lái)防治薊馬，但由于人們長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致昆蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)和化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境污染日益嚴(yán)重。幾丁質(zhì)是自然界中存在最普遍的氨基多糖，主要存在于真菌、線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物中。幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮、體內(nèi)組織基底膜和消化道圍食膜的主要成分，對(duì)昆蟲(chóng)的形態(tài)構(gòu)建及生命活動(dòng)具有重要的作用。由于幾丁質(zhì)在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起著關(guān)鍵性的作用，同時(shí)人類(lèi)和高等動(dòng)物不具備幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)的特性，因此，開(kāi)展幾丁質(zhì)合成途徑相關(guān)基因研究具有重要的理論意義與潛在應(yīng)用價(jià)值。（前人研究進(jìn)展）昆蟲(chóng)發(fā)育必須經(jīng)歷周期性脫皮和合成新皮的過(guò)程，這一過(guò)程伴隨著幾丁質(zhì)的合成和降解。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)的合成過(guò)程非常復(fù)雜，目前發(fā)現(xiàn)有8種酶共同參與其中：海藻糖酶（Trehalase）、己糖激酶（hexokinase）、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glucose-6-phosphateisomerase）、谷氨酸鹽：果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamine：fructose-6-phosphate AminotransferasC）、葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glucosamine-6-phosphate-N-acetyltr-ansferase）、磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶（phosphoacetyl-glucosamine mutasC）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）和幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase）。其中某一個(gè)過(guò)程受阻就會(huì)造成幾丁質(zhì)合成困難，導(dǎo)致昆蟲(chóng)因缺少幾丁質(zhì)而不能存活。UDP-N-acetylglucosaminepyrophosphorylase（UAP）作為幾丁質(zhì)合成途徑上的關(guān)鍵酶之一，其功能在黑腹果蠅Drosophila melanogaster、埃及伊蚊Aedesaegypti、家蠶Bombyxmori、赤擬谷盜Tribolium-caslaneum、甜菜夜蛾Jpodopteraexigua等真核生物中得到了研究。對(duì)真核生物和原核生物的UAP進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)UAP基因的氨基酸序列并不相似，但有一個(gè)相同L/MX2GXIGTX6PK氨基酸結(jié)構(gòu)域。通過(guò)對(duì)赤擬谷盜的TeUAP靶基因進(jìn)行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜由于幾丁質(zhì)合成量不足而導(dǎo)致死亡。RNA干擾甜菜夜蛾5齡第一天的幼蟲(chóng)SeUAP基因，會(huì)導(dǎo)致部分甜菜夜蛾出現(xiàn)蛹期畸形及死亡。同樣的結(jié)論也出現(xiàn)在對(duì)果蠅突變體的研究中，果蠅的DmUAP基因突變體存在許多缺陷，主要是角質(zhì)層和氣管形態(tài)的缺陷，導(dǎo)致缺陷的原因主要是幾丁質(zhì)含量的減少。[本研究切入點(diǎn)]幾丁質(zhì)對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育具有極其重要的意義，基于昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)代謝途徑開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型的殺蟲(chóng)劑成為植物保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于薊馬UAP的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]在西花薊馬基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)西花薊馬UAP基因進(jìn)行克隆、鑒定，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究該基因在西花薊馬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，并利用RNAi技術(shù)，觀察該基因?qū)ξ骰ㄋE馬生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為進(jìn)一步探討西花薊馬UAP的生理功能提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

西花薊馬由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供，用四季豆飼養(yǎng)于人工氣候箱（MGC-350HP-2，上海一恒科技有限公司）。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照L：D=14：10h。

1.2 西花薊馬UAP-ORF的克隆鑒定

在西花薊馬基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，獲得了FoccUAP基因開(kāi)放閱讀框序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物（表1）。西花薊馬總RNA的提取采用Trizol（Invitrogen公司）法，總RNA用EasyScrlptReverse Transcrlptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此作為PCR模板擴(kuò)增FoccUAP開(kāi)放閱讀框。PCR體系為20uL：2uL 10×Taq Buffer，2uL dNTPs（2.5mmol·L），1uL cDNA模板，上下游引物各0.5uL（10umol·L），0.5uL Taq酶，用ddHO補(bǔ)齊至20uL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min;95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1mm，反應(yīng)35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。取5uL PCR產(chǎn)物，加1uL 6×loadingbuffer混合上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。片段純化回收后用5uL與pEASY -T1Cloning Kit載體（北京全式金生物科技有限公司）連接，轉(zhuǎn)化后挑選陽(yáng)性克隆子送福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3FoccUAP序列特性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

使用DNA star軟件將克隆獲得的DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列;使用NCBIBlastx進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)，使用在線工具ExPASy（http：//web.Expasy.org/protparam）對(duì)蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dm.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，使用Conserved domams（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Stmcture/lexington/lexington.cgi？cmd=rps）預(yù)測(cè)FoccUAP的保守結(jié)構(gòu)域等。

經(jīng)過(guò)BLAST同源比對(duì)，從NCBI網(wǎng)站（https：www.Ncbi.Nlm.nih.gov）分別選取半翅目、雙翅目、等翅目、鞘翅目等共28個(gè)物種的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶UAP序列，與本研究克隆的FoccUAP序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。使用MEGA7軟件Neighbor Jommg方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4FoccUAP的時(shí)空表達(dá)

組織表達(dá)選取羽化24h的成蟲(chóng)300頭，在PBS緩沖液中解剖出觸角、頭、胸、腹、足;時(shí)間表達(dá)選取蛻皮24h的1齡若蟲(chóng)、2齡若蟲(chóng)、蛹和羽化24、48、168、240h的成蟲(chóng)各100只。Trizol法提取西花薊馬的總RNA，然后用EasyScrlpt ReverseTranscriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物（表1），同時(shí)以西花薊馬的β-actin基因（GenBank登錄號(hào)：XM 026432071.1）作為內(nèi)參（表1）。分別以FoccUAP基因在腹部和1齡幼蟲(chóng)的表達(dá)量作為組織表達(dá)和時(shí)間表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)參量。每組樣品重復(fù)3次。試驗(yàn)采用2的方法汁算FoccUAP基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR采用20uL體系：SYBR預(yù)混液（TakaRa）10uL，上下游引物（10gmol·L）各0.4uL，cDNA模板1uL，滅菌超純水8.2uL。PCR采用兩步法進(jìn)行：95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s，62℃退火15s，40次循環(huán)。

1.5 FoccUAP的dsRNA合成

根據(jù)已獲得的基因序列設(shè)計(jì)靶向FoccUAP的dsRNA干擾片段（dsUAP），同時(shí)根據(jù)綠色熒光蛋白序列設(shè)計(jì)用于對(duì)照的dsGFP片段（表1）。以PEASY-FoccUAP質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增特異性片段并回收，用HiScribe T7Quick High Yield RNA Synthesis Kit（NewEngland Biolabs）試劑盒合成dsRNA。體外轉(zhuǎn)錄體系為：ATP、GTP、UTP和CTP各2uL，T7RNAPolymerase Mix2uL，模板（DNA）1ug，10×Reactionbuffer 2uL，加RNase free water補(bǔ)至20uL，37℃反應(yīng)12h。最后在反應(yīng)體系加1uL DNase I（TakaRa），37℃ 30min除去DNA模板。合成的dsRNA梯度稀釋后使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000（Thermo）進(jìn)行質(zhì)量及濃度檢測(cè)，并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6RNAi注射試驗(yàn)及表型觀察

利用油壓式手動(dòng)微量注射儀（Cell Tramoil，Eppendorf）將質(zhì)量濃度為0.5ug·gL的dsFoccUAP和dsGFP分別注射到200只蛻皮24h的2齡西花薊馬若蟲(chóng)體腔。注射后72h和120h分別取出20只活蟲(chóng)檢測(cè)dsRNA的沉默效果。另外，在注射后12h，取30只活蟲(chóng)，單頭飼養(yǎng)于放置四季豆的飼養(yǎng)管中，每12h觀察存活情況和形態(tài)變化，共觀察144h，統(tǒng)計(jì)個(gè)體死亡率和成蟲(chóng)畸形率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

不同處理組之間的多重比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA，Tukey HSD test）（SPSS 21.0），差異顯著性檢驗(yàn)水平標(biāo)準(zhǔn)P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1FoccUAP的克隆與序列進(jìn)化分析

以西花薊馬總RNA合成的cDNA為模板，克隆得到與預(yù)期大小相符的目標(biāo)片段，經(jīng)測(cè)序獲得了西花薊馬FoccUAP的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），全長(zhǎng)1545bp，編碼514個(gè)氨基酸（圖1）。經(jīng)軟件SignalP 5.0預(yù)測(cè)，F(xiàn)occUAP含有信號(hào)肽，區(qū)域?yàn)榈?-10個(gè)氨基酸：MEHQYENLRN（圖1）。利用NCBI的Conserved domains功能對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)FoccUAP具有1個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：GlYco-tranf-GTA-typcsuperfamily結(jié)構(gòu)域（第89-411位氨基酸）（圖1）。

將FoccUAP氨基酸序列與其他28種昆蟲(chóng)UAP利用MEGA5.1鄰接法，以步長(zhǎng)值1000構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。圖中進(jìn)化樹(shù)可分為兩大支，其中FoccUAP與等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆蟲(chóng)的UAP親緣關(guān)系最近，序列最高同源性為56%（圖2）。

2.2FoccUAP的時(shí)空表達(dá)

利用RT-qPCR分析FoccUAP基因在西花薊馬不同發(fā)育階段的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明FoccUAP基因在蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，其中2齡幼蟲(chóng)、蛹以及羽化后24、48、168和240h的表達(dá)量分別是1齡幼蟲(chóng)的1.30、2.5、1.56、2.0、2.43、2.56倍（圖3-A）。此外，對(duì)提取羽化后24h的西花薊馬不同組織的總RNA進(jìn)行RT-qPCR分析FoccUAP基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)occUAP基因在西花薊馬各個(gè)組織都有表達(dá)，在頭部和腹部相對(duì)表達(dá)量最高，觸角、胸部和足表達(dá)量較低（圖3-B）。

2.3 dsRNA干擾對(duì)西花薊馬存活率和發(fā)育的影響

由圖4-A可知，顯微注射0.5ug·uL的dsUAP可顯著抑制FoccUAP基因的表達(dá)，觀察發(fā)現(xiàn)，注射dsGFP的西花薊馬羽化率為86.8%，而注射dsUAP的西花薊馬羽化率僅為36.3%，且在注射后120h的總存活率僅為5.o%（圖4-B）;此外，注射dsUAP的西花薊馬成蟲(chóng)出現(xiàn)翅膀發(fā)育不完整、胸腹部皺縮等畸形現(xiàn)象（圖4-C～D）。說(shuō)明UAP基因與西花薊馬的表皮發(fā)育和蛻皮有一定的關(guān)系。

3討論與結(jié)論

UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase，UAP）是生物合成中的關(guān)鍵酶，主要功能為催化可逆反應(yīng)N-乙酰氨基葡萄糖-1磷酸（N acetylglucosamme-1-phosphate，GlcNAc-1-P）+UTP形成UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）+ppi。UAP最早從金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureu中分離純化得到，隨后在小牛的大腦組織和念珠菌球蟲(chóng)Monilio-phthoraperniciosa中純化獲得。UAP在原核和真核生物的生理代謝活動(dòng)中均扮演重要作用。近年昆蟲(chóng)UAP的研究也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，埃及伊蚊Aedesaegypti、黑腹果蠅Drosophila melanogaster和甜菜夜蛾Jpodopteraexiguo等三十多種昆蟲(chóng)的UAP基因得到克隆鑒定。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)UAP基因與昆蟲(chóng)表皮、氣管和圍食膜中幾丁質(zhì)的合成密切相關(guān)，如黑腹果蠅D.melanogaster UAP基因缺陷導(dǎo)致蟲(chóng)體表皮的上皮組織畸形，氣管表現(xiàn)亦不正常，并且?guī)锥≠|(zhì)含量大量減少;赤擬谷盜Tribolium castaneum UAP基因?qū)ハx(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育及存活至關(guān)重要;利用dsRNA干擾東亞飛蝗Locusta migratoria UAP基因，其中腸和表皮中的幾丁質(zhì)合成都受到阻礙，最終導(dǎo)致蟲(chóng)體蛻皮障礙而死亡;在甜菜夜蛾S. exigua中將UAP基因沉默后，同樣可引起甜菜夜蛾化蛹障礙死亡。然而，纓翅目薊馬類(lèi)昆蟲(chóng)是目前農(nóng)作物生產(chǎn)上最為重要的害蟲(chóng)之一，還未見(jiàn)UAP研究報(bào)道。因此，開(kāi)展薊馬類(lèi)昆蟲(chóng)UAP基因功能研究具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

本研究首次克隆鑒定了薊馬類(lèi)害蟲(chóng)UAP基因，發(fā)現(xiàn)西花薊馬UAP基因與其他昆蟲(chóng)同源性較低，序列最高同源性?xún)H為56%，表明纓翅目昆蟲(chóng)在進(jìn)化上具有較高的保守性。從組織表達(dá)模式看，頭部FoccUAPmRNA相對(duì)表達(dá)量最高，表明頭殼發(fā)育過(guò)程中需要大量的幾丁質(zhì)，這與頭部比其他組織更加堅(jiān)硬相一致。此外，從時(shí)間表達(dá)模式看，蛹期和羽化168h和240h成蟲(chóng)的FoccUAP mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，這可能是由于蛹階段蟲(chóng)體需要形成翅以及更為堅(jiān)固蛹?xì)?，因此需要大量幾丁質(zhì)供給;而成蟲(chóng)階段FoeeUAP mRNA的高表達(dá)，該結(jié)果與UAP在甜菜夜蛾相似，說(shuō)明UAP除了與昆蟲(chóng)表皮、氣管和圍食膜中幾丁質(zhì)合成相關(guān)，可能還有其他未明確的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向蛻皮后24h的2齡若蟲(chóng)顯微注射質(zhì)量濃度為0.5ug的dsUAP抑制FoccUAP基因的表達(dá)，西花薊馬死亡率顯著增加;同時(shí)，注射dsUAP的西花薊馬化蛹率顯著降低且成蟲(chóng)胸腹部、翅膀出現(xiàn)畸形。這表明，UAP基因表達(dá)水平下降可能導(dǎo)致幾丁質(zhì)的前體物質(zhì)UDP-GlcNAc合成不足，從而使幾丁質(zhì)合成受阻而引發(fā)蟲(chóng)體畸形甚至死亡，其詳細(xì)的死亡機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次對(duì)西花薊馬UAP基因進(jìn)行克隆、鑒定，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究該基因在西花薊馬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，并利用RNAi技術(shù)觀察該基因?qū)ξ骰ㄋE馬生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為進(jìn)一步探討西花薊馬UAP基因的生理功能提供科學(xué)參考。