姚啟倫　李玉潔　陳發(fā)波　高健　李文博　方平　李紅艷

摘要：探討優(yōu)化玉米染色體滴片關(guān)鍵因子處理效果，尋求一種操作簡單、染色體分散度和完整性好，并且適于玉米染色體分離操作的制片方法。本研究以玉米自交系B73根尖為材料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用四因素二次回歸正交組合設(shè)計，分析玉米滴片技術(shù)中4個關(guān)鍵因子的處理效果。結(jié)果表明，NO處理時間、冰乙酸固定時間、酶解時間和滴片距離對染色體滴片效果均存在最佳處理效應(yīng)?；诙位貧w方程的統(tǒng)計方法得到了符合實際的優(yōu)化的染色體滴片技術(shù)方案，即采用NO處理時間2.0h、冰乙酸固定時間2.0h、酶解時間6.0h和滴片距離35.0cm。由此方案制作了高質(zhì)量的玉米染色體制片，保證了細胞中染色體的分散性和完整性。

關(guān)鍵詞：玉米;染色體;滴片;優(yōu)化

中圖分類號：S513

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0255-07

染色體作為基因的載體，一直是細胞遺傳學和分子生物學研究的熱點。染色體制片是觀察、鑒定染色體的基本方法，它是進行生物染色體組型分析、染色體顯帶、染色體畸變分析、染色體特殊成分鑒定、DNA原位雜交和單染色體分離研究的重要技術(shù)手段。傳統(tǒng)的染色體制片技術(shù)是壓片法和火焰干燥法，眾多學者就染色體制片過程中的取材時間、預(yù)處理方式、冰乙酸固定時間、細胞解離及染色方法等作了大量卓有成效的研究。潘頎等以新疆紫草為材料，用壓片法研究染色體制片技術(shù)，其研究結(jié)果表明，新疆紫草染色體制片效果主要取決于秋水仙素預(yù)處理時間、處理溫度和細胞解離時間3個關(guān)鍵處理因子。勞世輝等采用火焰干燥法制備菠蘿蜜染色體制片，通過比較不同預(yù)處理試劑和預(yù)處理時間的作用效果，發(fā)現(xiàn)以1：1（體積比）的8-羥基喹啉（0.002mol/L）與秋水仙素（0.2%）混合液預(yù)處理制片材料，可達到理想的染色體制片效果。陳雪等通過對射干染色體壓片技術(shù)研究指出，室溫下用秋水仙素（0.1%）預(yù)處理材料8h和379C下酶解材料60min，用壓片法可制作出染色體分散良好的制片。劉丹等通過比較分析多種植物的染色體壓片技術(shù)，認為壓片法中制約植物染色體制片效果的關(guān)鍵處理因子是預(yù)處理藥劑和時間。分子生物技術(shù)的發(fā)展對染色體制片技術(shù)提出新的更高的要求，一張高質(zhì)量的染色體制片要求處于有絲分裂中期相的細胞多，染色體交叉重疊少、分散性好，細胞內(nèi)容物少、清晰度高。染色體滴片法是新興的一種染色體制片方法，目前國內(nèi)鮮見有關(guān)染色體滴片技術(shù)研究的相關(guān)報道。為此，本試驗以遺傳學研究的模式生物一玉米為染色體制片材料，采用數(shù)理統(tǒng)計法分析影響染色體滴片效果的4個關(guān)鍵因子，為規(guī)范玉米染色體滴片技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用典型玉米自交系B73作染色體制片材料，玉米自交系B73種子由長江師范學院玉米育種課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體滴片制作

1.2.1.1 胚根在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪一層無菌紗布，放入預(yù)浸6h的玉米種子，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25C培養(yǎng)1～2d，待胚根長1.0～2.0cm時，剪取1.0～1.5cm根尖置入盛有超純水的EP管中，讓濕潤根尖貼于管壁。1.2.1.2 NO處理將裝有根尖的EP管放入NO處理罐，在0.5Pa的壓強下進行NO處理，NO處理罐由解壓閥、NO罐、連接管、處理罐和三通閥組成。

1.2.1.3 冰乙酸固定取出EP管并滴加適量90%冰乙酸對根尖材料進行固定處理。

1.2.1.4 材料漂洗固定后的根尖材料從EP管取出，在盛有超純水的培養(yǎng)皿中漂洗2～3次，然后置于載玻片切取根尖分生區(qū)。

1.2.1.5 制備細胞懸液根尖分生區(qū)材料在37C溫度下酶解，酶解后的材料用70%乙醇清洗2次，再置入瞬時離心機離心2次，每次8s，最后加入冰乙酸，搗碎混勻制成細胞懸液。

1.2.1.6 細胞懸液滴片用移液槍吸10μl細胞懸液，在一定高度依靠其自身重力直接滴加在載玻片上，待滴液干燥后進行染色處理。

1.2.1.7 鏡檢在光學顯微鏡下觀察、鑒定滴片中細胞有絲分裂中期染色體，并利用照像系統(tǒng)進行拍照記錄。

1.2.2 制訂染色體制片評分標準以染色體滴片效果為考察指標，根據(jù)有絲分裂中期相的細胞數(shù)、染色體重疊率、單細胞染色體數(shù)和細胞內(nèi)溶物面積比4個參數(shù)值，對染色體滴片效果進行評定等級，其評分標準見表1。

1.2.3 試驗設(shè)計基于前期大量的玉米染色體滴片試驗，單因素試驗設(shè)計參照賈建的方法，按不同的試驗設(shè)計，選擇不同的NO處理時間（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、冰乙酸固定時間（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、酶解時間（5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h）和滴片距離（10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0cm）。用二次回歸正交組合設(shè)計分析染色體滴片效果與各關(guān)鍵因子間的線性關(guān)系。單因素試驗設(shè)計得到的最優(yōu)處理作為二次回歸正交設(shè)計的零水平，進行回歸正交試驗，建立染色體滴片效果與各關(guān)鍵因子的回歸方程，以探究玉米染色體滴片法的最佳技術(shù)方案。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，利用DPS軟件進行二次回歸正交組合設(shè)計統(tǒng)計分析，建立回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 各關(guān)鍵因子對染色體滴片的處理效果

由表2可知，NO處理時間分別為1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h時，玉米染色體滴片效果的得分等級分別為1、2、5、4和3，以2.0hNO處理時間的評分等級最高，染色體滴片效果最好（圖1a3）。冰乙酸固定根尖材料時間分別為1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h時，其滴片效果的得分等級分別為1、2.5、4和3，以2.0h固定時間的染色體滴片效果最好（圖1b3），評分等級最高。酶解時間分別為5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h時，其滴片效果的得分等級分別為3、4、5、2和1，以酶解時間為6.0h的染色體滴片效果最好（圖1c4），評分等級最高。滴片距離分別為10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0em時，其滴片效果的得分等級分別為1、3、5、4和2，以30.0cm距離的染色體滴片效果最好（圖1d3），評分等級最高。

2.2 二次回歸正交設(shè)計及回歸分析

據(jù)單因素試驗結(jié)果，二次回歸正交組合設(shè)計零水平分別為2.0h、2.0h、6.0h和30.0cm。關(guān)鍵處理因子NO處理時間的上下水平分別為1.0h和3.0h，冰乙酸固定時間的上下水平分別為1.0h和3.0h，酶解時間的上下水平分別為5.0h和7.0h，滴片距離的上下水平分別為10.0cm和50.0cm。由m=4、m，=3，選用γ=1.547，設(shè)計4個因素：NO處理時間（Z）、冰乙酸固定時間（Z2）、酶解時間（Z3）和滴片距離（Z4），相應(yīng)編碼為x、x、x和x，列出因素水平編碼表（表3），將試驗設(shè)計中的編碼水平轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的實際水平，即得試驗實施方案（表4）。

據(jù)四因素二次回歸正交組合設(shè)計表，整理數(shù)據(jù)后得到四因素二次回歸正交組合設(shè)計結(jié)構(gòu)矩陣及試驗結(jié)果計算表（表5），由此建立回歸方程：Y=6.18-0.25x+0.12x-0.29x+0.19x-0.30xx+0.10xx+0.06xx+0.29xx-0.03xx-0.13xx-1.47x’-1.41x'-1.45x'-1.20x'。

據(jù)表6顯著性檢驗結(jié)果，x、x、x和x，的二次項均達到極顯著水平，其余各項回歸系數(shù)均不顯著，說明x、x、x和x的二次項對試驗結(jié)果有極顯著影響，回歸關(guān)系極顯著，由此建立的數(shù)學模型與實際情況擬合較好。據(jù)平方項中心化公式：x’=x（x0）/n=x0.77，得到回歸方程：Y=10.44-0.25x+0.12x-0.29x+0.19x-0.30x₁x+0.10xx+0.06xx+0.29xx-0.03xx-0.13xx-1.47x-1.41x-1.45x-l.20x。以Y值最大為目標函數(shù)，通過確定參數(shù)x（j=1，2，3，4）的最優(yōu)值。當Y值最大時，據(jù)目標函數(shù)解得x=-0.078，x=0.040，x=-0.110，x=0.360，將x=（Z-2）/0.65，x2=（Z2）/0.65，x=（Z-6）/0.65，x=（Z-30）/12.93代入得到實際因素Z=1.95，Z=2.04，Z=5.93，Z=34.65

綜上所述，根據(jù)回歸方程，優(yōu)選出各關(guān)鍵處理因子的最佳方案，基于試驗操作的實際性，采用取整法，即得到本試驗玉米染色體滴片法關(guān)鍵處理因子的最佳技術(shù)方案：NO處理時間2.0h，冰乙酸固定時間2.0h，酶解時間6.0h，滴片距離35.0cm。

3 討論

3.1 影響染色體滴片效果的主要因素

滴片法的操作步驟有取材、預(yù)處理、固定、解離和滴片。材料預(yù)處理的目的是改變細胞內(nèi)染色體形態(tài)及分散狀態(tài)，常采用秋水仙素、8-羥基喹啉和a-溴萘等藥劑進行化學處理，本研究對材料的預(yù)處理則是通過增壓條件下的NO處理達到改良細胞內(nèi)染色體狀態(tài)的目的，同時避免了秋水仙素等化學試劑帶來的毒害和污染。材料固定的目的是使材料快速失活和蛋白質(zhì)沉淀，使材料保持初始狀態(tài)，卡諾氏I固定液和甲醇冰乙酸（1：3，體積比）混合液是常用的固定液，固定液固定時間是影響染色體壓片技術(shù)的因素之一，本試驗選擇冰乙酸固定材料2h，取得了較好的效果。解離是植物染色體制片過程的重要環(huán)節(jié)，解離能分解細胞壁，消除細胞內(nèi)溶物，增加染色體清晰度，解離方法有酸解法和酶解法，酸解法往往因酸解過度造成染色體損傷，目前多采用酶解法，對于酶解時間，回歸分析選優(yōu)結(jié)果表明，采用2%纖維素酶和0.5%果膠酶混合液37C下酶解材料6.0h最適宜滴片法制片。不同于壓片法和火焰干燥法，滴片法的制片質(zhì)量取決于滴片技術(shù)，而滴片距離直接決定染色體制片的成敗，滴片距離過小，細胞內(nèi)染色體交叉重疊、分散性差，滴片距離過大則細胞內(nèi)染色體過度分散、細胞間染色體混雜，回歸分析選優(yōu)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞懸液以35.0cm的距離滴片可獲得分散性好、細胞內(nèi)染色體數(shù)目完整的高質(zhì)量制片。滴片法常規(guī)試驗中多采用20.0cm左右的滴片距離，35.0em的滴片距離在實際操作中可能存在滴片不準、細胞懸浮液流向邊緣導(dǎo)致浪費等問題。因此，在實際的試驗操作中，需綜合考慮，或反復(fù)進行滴片技術(shù)的訓(xùn)練，以達到最佳的制片效果。

3.2 植物染色體制片技術(shù)

染色體制片質(zhì)量是制約細胞生物學和分子生物學發(fā)展的重要因素，一張高質(zhì)量的染色體制片要求細胞有絲分裂中期相多、染色體分散無重疊及染色體完整性好。目前國內(nèi)外通常采用壓片法和低滲涂片法進行染色體制片。染色體壓片技術(shù)作為常用的染色體制片方法，被廣泛應(yīng)用于各類生物，尤其是植物染色體研究。壓片法雖然操作簡單實用，但需要適宜的取材時間和嫻熟的壓片技術(shù)，對操作者的操作技術(shù)要求較高。染色體低滲涂片技術(shù)的核心是將試驗材料均勻涂布在載玻片，上，從而有效降低壓片法所造成的染色體重疊。低滲涂片法盡管對操作技術(shù)要求不高，且制片效果較好，但其操作過程涉及火焰干燥和蓋玻片壓片，從而影響染色體完整性。染色體滴片法是將處理后的試驗材料搗碎于冰醋酸溶液，然后制成細胞懸液，細胞懸液利用自身重力滴落在玻片上，保證了細胞中染色體的分散性和完整性。滴片法是一種新的染色體制片方法，目前國內(nèi)尚未見有關(guān)滴片技術(shù)研究的相關(guān)報道，鑒于滴片法的技術(shù)優(yōu)勢，它將廣泛應(yīng)用于染色體研究，進而促進細胞遺傳學和分子生物學的發(fā)展。為規(guī)范染色體滴片技術(shù)，本研究基于前期的染色體滴片技術(shù)經(jīng)驗，通過設(shè)置染色體滴片技術(shù)關(guān)鍵處理因子，采用回歸分析模型，確立了最佳玉米染色體滴片技術(shù)方案。由此制作了高質(zhì)量的染色體制片，制片中細胞有絲分裂中期相多、細胞內(nèi)溶物和雜質(zhì)少、染色體著色均勻、染色體交叉重疊少、具有完整染色體組（2n=20）的細胞較多。

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