程夢云 茍劍喻 楊茂 趙建 彭玉龍 黃鶯

摘 要：為了研究鎂對烤煙葉片氮代謝關(guān)鍵酶的影響，以烤煙品種K326為試驗(yàn)材料，采用水培方式，設(shè)置不同Mg.2+濃度處理，測定了與氮代謝中相關(guān)的硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）活性。結(jié)果表明：在烤煙的生長的不同時(shí)期，NR活性呈先降低后升高再降低的趨勢，GS活性呈先降低后升高的變化趨勢，GOGAT活性呈逐漸減弱的趨勢;在同一時(shí)期，不同Mg.2+濃度處理下煙葉NR活性有顯著差異， Mg.2+濃度為6 mmol/L時(shí)NR活性和GS活性最強(qiáng)，鎂濃度的升高有利于GOGAT活性增強(qiáng)。結(jié)果表明Mg.2+濃度為6 mmol/L時(shí)，可提高煙草植株氮代謝關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)無機(jī)氮向有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：烤煙;鎂濃度;硝酸還原酶;谷氨酰胺合成酶;谷氨酸合成酶

中圖分類號：S572

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）02-0048-04 ? ? 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.02.009

Abstract： ?In order to study the effect of magnesium on key enzymes of nitrogen metabolism in tobacco leaves， using flue-cured tobacco variety K326 as experimental material，hydroponics experiment with treatment of different magnesium concentration was conducted， and the activities of nitrate reductase （NR）， glutamine synthetase （GS） and glutamate synthase （GOGAT） related to nitrogen metabolism were determined. The results showed that NR activity decreased first， then increased and finally decreased， while GS activity decreased first and then increased， and GOGAT activity decreased gradually during the whole growth process of tobacco. At the same stage， there were significant differences in the NR activity among different treatments. NR activity and GS activity were the strongest when Mg.2+ concentration was 6 mmol/L， the increase of magnesium concentration was beneficial to the activity of GOGAT. The results indicated that Mg.2+ with the concentration of 6 mmol/L could increase the activity of key enzymes in nitrogen metabolism of tobacco plants， promoting the conversion of inorganic nitrogen to organic nitrogen.

Key words：tobacco; magnesium concentration; nitrate reductase; glutamine synthase; glutamate synthase

鎂是植物必需營養(yǎng)元素，缺鎂或過量脅迫均會影響植物葉片的生長發(fā)育[1]，鎂過量則會導(dǎo)致煙葉儲存時(shí)吸濕性增強(qiáng)[2-3]。鎂對氮代謝及其產(chǎn)物有著重要的影響，鎂可以穩(wěn)定核糖體結(jié)構(gòu)，為蛋白質(zhì)的合成提供場所;在氨基酸的活化、多肽鏈合成的啟動和多肽鏈的延長等蛋白質(zhì)合成過程中，也需要鎂的參與;鎂也能激活谷氨酰胺合成酶;在固氮過程中，鐵氧還原蛋白則與Mg-ATP結(jié)合，向固氮酶的活性中心提供能量和傳遞電子[4]。在氮代謝中包含了無機(jī)氮的還原、同化及有機(jī)含氮化合物的合成、轉(zhuǎn)化和分解的過程[5]。氮素還原過程是氮代謝的重要環(huán)節(jié)，是將植物體內(nèi)的硝態(tài)氮還原成氨的過程[6]，氮同化則是將氨最終同化形成氨基酸的過程。硝酸還原酶（NR），谷氨酰胺合成酶（GS）及谷氨酸合成酶（GOGAT）是影響氮代謝的關(guān)鍵酶，硝酸還原酶作為氮代謝的限速酶，可調(diào)節(jié)NO.-的還原，從而調(diào)節(jié)氮代謝[7]。氮素同化過程中，谷氨酰胺合成酶將NH4.+同化形成谷氨酰胺，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成谷氨酸，形成氨基酸，進(jìn)而形成不同的蛋白質(zhì)[7]。因此，NR和GS活性的強(qiáng)弱對氮素利用具有重要影響。本文采用水培的方式，控制體系的養(yǎng)分離子濃度及pH條件，研究不同鎂濃度對氮代謝關(guān)鍵酶的影響，從而為合理施用鎂肥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為K326，試驗(yàn)于2017年在貴州省平壩縣貴州大學(xué)煙草試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用水培方式進(jìn)行試驗(yàn)，水培營養(yǎng)液以B.Hoagland配方為基礎(chǔ)調(diào)整后使用。根據(jù)鎂離子濃度設(shè)置0、2、4、6、8、10 mmol/L共6個處理，重復(fù)3次。

采用30 cm×30 cm 的培養(yǎng)盆，上面采用定植板和定植網(wǎng)固定煙苗，煙苗通過定植孔中的定植網(wǎng)固定在板上，每盆裝營養(yǎng)液5 L，栽植1株煙苗。煙苗長至4葉1心時(shí)移植。營養(yǎng)液用蒸餾水配置，各種養(yǎng)分均用分析純（AR）試劑提供。營養(yǎng)液每7天更換一次，伸根期每天充氧5分鐘，其他生育期每天充氧10分鐘。

1.3 樣品采集及測定方法

移栽后待煙苗長至伸根期（5月26日）、團(tuán)棵期（6月10日）、旺長中期（7月1日）、現(xiàn)蕾期（7月14日），取中部葉片經(jīng)液氮處理后，儲藏于-78℃低溫冰箱中用于硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOAST）活性的測定。稱取0.1g煙草葉片用液氮研磨至粉末狀，采用試劑盒（蘇州科銘）提取組織樣品的原液，NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對—氨基苯磺酸及α—萘胺定量生成紅色偶氮化合物;產(chǎn)生的紅色偶氮化合物在540 nm有最大吸收峰值。GS在ATP和Mg.2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下與鐵形成紅色的絡(luò)合物;該絡(luò)合物在540 nm處有最大吸收峰。GOGAT催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α—酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸，同時(shí)NADH氧化生成NAD+，340 nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。經(jīng)試劑盒的待測液用酶標(biāo)儀（Bio Tek EON）測定各指標(biāo)。每個指標(biāo)均測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和DPS7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎂濃度對烤煙葉片NR活性的影響

NR是植物體內(nèi)將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，也是限速酶，其活性高低反應(yīng)了植物體氮代謝狀況。由不同處理下烤煙葉片NR活性（圖1）可看出，隨著烤煙生育期的延長，NR活性呈先降低后升高再降低的趨勢，表明烤煙生育前期氮代謝旺盛，NR活性最強(qiáng)。

不同鎂濃度對NR活性是有影響的，在伸根期，隨著鎂濃度的升高，NR活性呈下降趨勢，T1處理與其他處理差異均達(dá)到顯著水平，T2處理與T3，T5，T6處理均達(dá)到差異性顯著，且T1處理NR活性顯著高于其它處理，T2處理NR活性顯著高于T3、T4、T5、T6處理。在團(tuán)棵期、旺長中期，雖然各處理間NR活性差異均未達(dá)到顯著水平，但團(tuán)棵期T1處理下的NR活性最高，隨著鎂濃度的升高，NR活性仍表現(xiàn)出下降趨勢;在旺長中期，T1～T3處理NR活性較低，T4～T6處理隨鎂濃度的升高NR活性呈下降的趨勢?，F(xiàn)蕾期隨鎂濃度的升高，各處理間差異不顯著，NR活性變化的趨勢趨于穩(wěn)定。由此可以看出，NR活性在T4處理時(shí)活性更強(qiáng)一些，而在T5和T6處理下，NR的活性會受到抑制。說明適量增施鎂肥，在煙葉生長最關(guān)鍵的旺長中期可提高葉片 NR活性，促進(jìn)煙株氮代謝，Mg.2+濃度為6 mmol/L 的T4處理效果最佳，而當(dāng)Mg.2+濃度超過6 mmol/L時(shí)會抑制NR的活性。

2.2 鎂濃度對烤煙葉片GS活性的影響

GS是植物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶，其活性控制著植物體內(nèi)氮素的運(yùn)轉(zhuǎn)和分配。不同鎂濃度處理下的烤煙葉片GS活性顯示（圖2），烤煙的整個生長時(shí)期中，各處理的GS活性變化趨勢基本一致，呈先降低后升高的變化趨勢，在團(tuán)棵期活性最低，而在現(xiàn)蕾期達(dá)到最高值。

不同處理對GS活性的影響有差異：伸根期除T4處理的GS活性顯著低于T6處理外，與處理相比差異均不顯著;在團(tuán)棵期，T4、T6處理間的GS活性差異不顯著，但顯著低于T3、T5、T2、T1處理，而T3、T5、T2、T1處理間差異不顯著;在旺長中期，T5處理的GS活性顯著高于其余5個處理，T4處理次之，T3處理最低;在現(xiàn)蕾期，T4處理的GS活性顯著高于其余5個處理，T3處理次之，T5處理最低。說明在旺長中期和現(xiàn)蕾期，Mg.2+濃度為6 mmol/L 的T4處理最有利于促使更多的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，降低煙葉中游離銨離子積累。

2.3 鎂濃度對烤煙葉片GOGAT活性的影響

GOGAT同樣作為植物體內(nèi)氮素同化與循環(huán)的關(guān)鍵酶，在GS/GOGAT循環(huán)中，GOGAT是該途徑的限速酶。不同鎂濃度處理下烤煙葉片GOGAT活性（圖3）可看出，在團(tuán)棵期至現(xiàn)蕾期，GOGAT的活性均呈逐漸減弱的趨勢。

在伸根期，處理間差異達(dá)到顯著， T2處理GOGAT活性最強(qiáng)，T5處理次之，T6處理的GOGAT活性最弱;在團(tuán)棵期，處理間差異也達(dá)到顯著，T5處理GOGAT活性最強(qiáng)，T3處理次之，T2處理的GOGAT活性最弱;在旺長中期，各處理間差異縮小，但也達(dá)到顯著水平，T3處理的GOGAT活性最強(qiáng)，T6處理次之，T4處理最弱;現(xiàn)蕾期各處理間GOGAT活性差異顯著，T3處理的GOGAT活性最強(qiáng)，T6處理次之，T1處理最弱。不同生育期GOGAT變化較為復(fù)雜，并未隨濃度表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，但可以看出，添加鎂的處理GOGAT活性均高于T1，說明Mg.2+濃度的提高是可以促進(jìn)GOGAT活性，有利于氮素同化的。

3 結(jié)論與討論

氮代謝是植物的重要生理代謝之一，且在各個環(huán)境中生長的植物機(jī)體內(nèi)都具有重要作用[8]。氮代謝可為碳代謝提供光合色素和酶，從而與碳代謝共同促進(jìn)植物的生長發(fā)育[9]。鎂作為葉綠素卟啉環(huán)的中心原子，只有鎂原子同葉綠素分子結(jié)合后，才具備吸收光量子的必要結(jié)構(gòu)，才能有效地吸收光量子進(jìn)行光合碳同化反應(yīng)。植物只有正常的進(jìn)行光合作用，烤煙才能進(jìn)行將無機(jī)碳轉(zhuǎn)化為有機(jī)碳的同化代謝。本研究結(jié)果表明不同鎂離子濃度對氮代謝中的硝酸還原酶，谷氨酰胺合成酶以及谷氨酸合成酶均有影響。

硝酸還原酶的活性與光合作用有密切關(guān)系，在葉綠體中硝酸鹽的還原作用主要依賴與光合作用提供的還原力。當(dāng)鎂離子含量低時(shí)，不能更好地與葉綠素分子結(jié)合，從而會影響光合作用，最終會影響氮素還原。硝酸還原酶作為氮代謝過程的第一個酶，其活性較低，對外部條件敏感，較不穩(wěn)定，所以硝酸還原酶的活力對硝酸還原有一定的限制作用，其活性強(qiáng)弱會直接影響氮代謝能力的高低[10-11]。在植物體各部位中硝酸還原酶活性也有所不同，一般在幼嫩組織中，硝酸還原酶活性高，而在衰老組織中的活性較低[12]。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨烤煙的生長，各處理間硝酸還原酶活性變化趨勢基本一致，呈先降低后升高再降低的趨勢，烤煙生育前期氮代謝旺盛，NR活性最強(qiáng)。在鎂離子濃度為6 mmol/L時(shí)，硝酸還原酶活性最強(qiáng)，鎂離子濃度大于6 mmol/L，硝酸還原酶的活性將會受到抑制。這說明適量的Mg.2+可促進(jìn)NR的活性。而NR活性的增強(qiáng)有利于氨基酸的合成并促進(jìn)植物生長[13]。

經(jīng)過硝酸還原酶對NO3.-的還原后，最終經(jīng)亞硝酸還原酶將NO2.-還原為NH4.+，進(jìn)入氮同化途徑。在同化NH4.+時(shí)，GS和GOGAT同時(shí)起作用[14]，GS/GOGAT途徑是植物氨同化的重要方式，是發(fā)生在葉綠體中的連續(xù)反應(yīng)。谷氨酰胺合成酶對氨有高的親和力，可保證葉綠體中NH3維持在很低的水平，所以GS作為谷氨酰胺合成的關(guān)鍵酶，可以提高氮素利用率。而鎂在此過程中，其主要作用是激活谷氨酰胺合成酶，因此鎂在氮代謝的同化過程中也具有重要的作用。有研究表明[15]，氮代謝關(guān)鍵酶GS活性強(qiáng)，氮的同化能力就強(qiáng)，氮素利用率較高。在對谷氨酰胺合成酶的分析中，可以看出，GS的活性并沒有在某一個濃度的所有時(shí)期達(dá)到最大值，而在NR活性最強(qiáng)的6 mmol/L處，伸根期和團(tuán)棵期的GS活性最弱，說明在Mg.2+濃度為6mmol/L時(shí)，煙株生育前期氮還原能力較強(qiáng)而氮同化能力較弱，氮素利用率低。而GS活性在旺長中期呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，且在現(xiàn)蕾期，GS的活性在鎂離子濃度為6 mmol/L達(dá)到最強(qiáng)，這說明在煙草后期生長中，濃度為6 mmol/L的鎂離子可更好的激活谷氨酰胺合成酶，提高GS活性，增強(qiáng)氮同化，提高氮素利用，這有利于干物質(zhì)的積累。

GOGAT作為氮素同化中同樣重要的酶，在氮素同化中與GS共同起作用，它在GS/GOGAT循環(huán)中為限速酶[16-17]。在本試驗(yàn)中，不同生育期GOGAT活性隨鎂濃度的增加并未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，這可能是由于經(jīng)GOGAT將谷氨酰胺和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)變?yōu)?分子谷氨酸后，一份子谷氨酸用作GS的底物，另一谷氨酸用于合成蛋白質(zhì)，核酸等含氮化合物中，在不同時(shí)期的不同濃度下兩個途徑所分配的谷氨酸含量有所不同，所以GOGAT活性隨鎂濃度的變化沒有明顯的規(guī)律，且GOGAT活性變化與鎂濃度的高低無關(guān)。但是添加鎂的處理GOGAT活性均高于T1處理，說明Mg.2+濃度的提高可促進(jìn)GOGAT活性，有利于氮素同化。

綜上所述，在煙株生長過程中，當(dāng)Mg.2+濃度為6 mmol/L時(shí)，可增強(qiáng)氮代謝關(guān)鍵酶活性，促進(jìn)無機(jī)氮向有機(jī)氮轉(zhuǎn)化，提高氮素利用率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 澤，譚曉風(fēng)，盧 錕，等.供鎂水平對油桐幼苗生長及光合特性的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志，2015（09）：2440-2447.

[2] 錢曉剛，楊 俊，朱瑞和.煙草營養(yǎng)與施肥[M].貴陽：貴州科技出版社，1998：58-62.

[3] 曹志洪.優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)的鉀素與微量元素[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1995：63-68.

[4] 陸景陵，植物營養(yǎng)學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011：67-70.

[5] 史宏值，韓錦峰，趙 鵬，等.不同氮含量于氮源下烤煙淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶活性動態(tài)變化[J].土壤學(xué)報(bào)，1989（02）：117-123.

[6] 許振柱，周廣勝. 植物氮代謝及其環(huán)境調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15（3）：511-516.

[7] 李 延，劉星輝，莊衛(wèi)民.植物Mg素營養(yǎng)生理的研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29（1）：74-80.

[8] Jessie F， Richard A. Linking carbon and nitro-gen metabolism to depth distribution of submersed macrophytes using high ammonium dosing tests and a lake survey[J].Freshwater Biology， 2013，12： 2532-2540.

[9] 李 娟.植物鉀、鈣、鎂素營養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].福建稻麥科技，2007，25（1）39-42.

[10] 阮建云，管彥良，吳洵.茶園土壤鎂供應(yīng)狀況及鎂肥施用效果研究[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（7）：815-820.

[11] 羅華元，程昌新，王紹坤，等.綠肥翻壓對烤煙大田期煙葉酶活性及烤后煙葉品質(zhì)的影響[J].山地生物學(xué)報(bào)，2010，29（6）：495-501.

[12] 艾復(fù)清，柳 強(qiáng)，翟 欣，等.紅花大金元不同成熟度幾種酶活性變化規(guī)律的研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2009，28（6）：471-474.

[13] 李 志，史宏志，劉國順，等.施氮量對皖南沙壤土烤煙碳氮代謝動態(tài)變化的影響[J].土壤，2010，42（1）：8-13.

[14] 徐曉鵬，傅向東，廖 紅.植物銨態(tài)氮同化及其調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2016，51（2）：152-166.

[15] 李亞飛，常 棟，孫軍偉，等.烤煙和白肋煙苗氮代謝的差異分析[J].煙草科技.2017，50（1）：6-11.

[16] Joy K W，Blackwell R D，Lea P J.Assimilation of nitrogen in mutant slacking enzymes of the glutamate synthase cycle[J].Journal of Experimental Botany，1992，43（ 247） ： 139-145.

[17] Lea P J，Miflin B J.Alternative route for nitrogen assimilation in higher plants[J].Nature，1974，251（ 5476） ： 614.