葉云飛　陳柏秀

[摘要] 目的 研究白細(xì)胞介素6（IL-6）和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）產(chǎn)婦胎盤組織中的表達(dá)及二者間的關(guān)系。 方法 選取2016年1月～2017年12月于廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）產(chǎn)科門診產(chǎn)檢并住院分娩的ICP產(chǎn)婦50例（ICP組），其中重度ICP組25例，輕度ICP組25例;同時(shí)取同期于我院分娩的健康產(chǎn)婦30名為對照組，搜集其胎盤組織采用免疫組織化學(xué)法檢測IL-6及STAT3的表達(dá)。 結(jié)果 ICP組孕婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中IL-6和STAT3陽性表達(dá)率明顯高于對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而在ICP輕度組和ICP重度組中兩者陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;IL-6和STAT3在對照組、ICP輕度組、ICP重度組產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽性表達(dá)率呈遞增趨勢;ICP組IL-6與STAT3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.694，P < 0.01）。 結(jié)論 IL-6及STAT3信號通路表達(dá)水平與ICP發(fā)病程度呈正相關(guān)，可作為聯(lián)合診斷和病情評估的重要指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 白細(xì)胞介素6;信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3;妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥;胎盤組織

[中圖分類號] R714.25? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（b）-0068-04

Expression and significance of IL-6 and STAT3 in the maternity placenta tissues with intrahepatic cholestasis of pregnancy

YE Yunfei? ?CHEN Baixiu

Department of Obstetrics， Liuzhou General Hospital Attached to Guangxi University of Technology， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou? ?545006， China

[Abstract] Objective To study the expression and the correlations of interleukin-6 （IL-6） and signal transducer and activator transcription 3 （STAT3） in the placentas of pregnant women with intrahepatic cholestasis of pregnancy （ICP）. Methods A total of 50 pregnant women with ICP and in Obstetrics Clinic of Liuzhou General Hospital Attached to Guangxi University of Technology （“our hospital” for short） from January 2016 to December 2017 was selected as ICP group， including 25 cases of mild ICP group， 25 cases of severe ICP group. At the same time， 30 healthy pregnant women taking prenatal examination in our hospital at the same period were selected in control group. Placentas of the above gravidas were collected and the expression and localization of IL-6 and STAT3 were determined via immunohistochemistry. Results The IL-6 and STAT3 positive cell rate of ICP group were significantly higher than those of control group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. There were no significant differences in positive cell rate between mild ICP group and severe ICP group （P > 0.05）. The positive expression rate of IL-6 and STAT3 were gradually increased in placental trophoblast among the control group， mild ICP group and the severe ICP group. There were positive relations between IL-6 and STAT3 expression in ICP group （r = 0.694， P < 0.01）. Conclusion The expression levels of IL-6 and STAT3 are positively correlated with the disease of ICP， which therefore might be used as combined diagnosis and evaluation of the state disease.

[Key words] Interleukin-6; Signal transduction and activator of transcription 3; Intrahepatic cholestasis of pregnancy; Placental tissue

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是一種妊娠特發(fā)性疾病，多發(fā)生于妊娠中晚期，表現(xiàn)為不明原因皮膚瘙癢、肝功能異常，而產(chǎn)后癥狀迅速消失，肝功能恢復(fù)正常[1]，可導(dǎo)致圍生兒發(fā)病率及死亡率增加。ICP發(fā)病機(jī)制尚未明確，但普遍認(rèn)為其發(fā)生是多種因素共同作用引起，包括遺傳變異、免疫功能失常、內(nèi)分泌及環(huán)境因素等，而信號通路的相關(guān)研究少見報(bào)道。本研究通過檢測ICP患者胎盤組織中白細(xì)胞介素-6/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（IL-6/STAT3）通路的表達(dá)及變化，從信號通路角度研究與ICP進(jìn)展的內(nèi)在聯(lián)系及相互關(guān)系，為進(jìn)一步探討ICP的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2017年12月于廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）產(chǎn)科住院分娩、資料完整的50例ICP產(chǎn)婦為研究對象（ICP組），其中ICP輕度組（25例），ICP重度組（25例），同時(shí)取我院同期分娩的健康產(chǎn)婦30名為對照組。ICP產(chǎn)婦納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)2015年發(fā)布的《妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診療指南（2015）》[2]對ICP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：胎位異常、多胎妊娠、頭盆不稱;免疫系統(tǒng)方面疾病、肝膽疾病;具有妊娠期高血壓、心臟病及糖尿病等妊娠合并癥;有復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、死胎、畸胎等不良孕產(chǎn)病史;有長期服用藥物及吸煙史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，參與研究者均知情同意。

1.2 ICP的分度標(biāo)準(zhǔn)

ICP分度標(biāo)準(zhǔn)：①輕度ICP，血清總膽汁酸（TBA）10～40 μmol/L;臨床癥狀：瘙癢為主，無明顯其他癥狀。②重度ICP，TBA≥40 μmol/L;臨床癥狀：瘙癢嚴(yán)重;伴有其他情況：復(fù)發(fā)性ICP、曾因ICP致圍生兒死亡者。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

比較兩組產(chǎn)婦的早產(chǎn)率、羊水糞染率及TBA、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。搜集兩組產(chǎn)婦的胎盤，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（SP）超敏免疫組化試劑盒檢測胎盤組織IL-6及STAT3的表達(dá)。胎盤娩出后10 min內(nèi)，避開胎盤鈣化灶、梗死區(qū)取胎盤母體面組織2塊約1 cm×1 cm×1 cm大小，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后放入10%甲醛中固定，予以酒精梯度脫水，二甲苯透明后常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm厚的薄片備用。操作嚴(yán)格按SP法試劑盒步驟進(jìn)行，兔抗IL-6、STAT3抗體試劑盒（購自上海生工生物工程股份有限公司），陽性對照取已知陽性片，陰性對照用PBS代替一抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色。

1.4 結(jié)果判讀方法

IL-6定位在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞漿，STAT3定位在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞漿和胞核，IL-6、STAT3陽性信號為呈現(xiàn)棕黃色顆粒，按陽性細(xì)胞百分率評分：0%～5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～75%為2分，>75%為3分。按細(xì)胞質(zhì)或胞核著色程度評分：未著色為0分，淺黃色著色為1分，棕黃色著色為2分，棕褐色著色為3分，將兩項(xiàng)得分相乘，<2分判為陰性（-），≥2分為陽性（+）。所有結(jié)果經(jīng)過2位病理科診斷醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行確認(rèn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman分析IL-6及STAT3表達(dá)相關(guān)性，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)婦妊娠資料比較

對照組與ICP組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = -0.592，P = 0.556，P > 0.05）。ICP組產(chǎn)婦終止妊娠的孕齡小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），ICP重度組產(chǎn)婦終止妊娠的孕齡小于ICP輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。對照組、ICP輕度組、ICP重度組產(chǎn)婦的早產(chǎn)率、羊水糞染率、TBA、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）呈上升趨勢，對照組與ICP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。ICP重度組的早產(chǎn)率、羊水糞染率稍高于ICP輕度組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），ICP重度組的產(chǎn)婦TBA、ALT、AST均高于ICP輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1～2。

2.2 IL-6及STAT3在產(chǎn)婦胎盤組織中陽性表達(dá)情況比較

在對照組、ICP輕度組及ICP重度組的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，IL-6定位在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞漿中，見圖1（封四）;STAT3定位在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞漿和胞核中，見圖2（封四）。ICP組的IL-6及STAT3的陽性表達(dá)率明顯高于對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），ICP重度組IL-6及STAT3的陽性表達(dá)率稍于ICP輕度組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。IL-6、STAT3在對照組、ICP輕度組、ICP重度組產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽性表達(dá)率逐漸升高。ICP組中，IL-6與STAT3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.694，P < 0.01）。見表3～4。

3 討論

ICP作為妊娠期特發(fā)性肝臟疾病，多合并有肝功能異常[3]，表現(xiàn)為血清總膽汁酸水平升高，血清總膽汁酸水平升高損傷細(xì)胞膜和線粒體膜，使得生物膜受損程度加重，ALT、AST水平升高進(jìn)一步可導(dǎo)致TBA水平升高，肝功能損害越重，圍生兒不良結(jié)局的發(fā)生率越高[4]。有此合并癥的孕婦較易發(fā)生胎兒宮內(nèi)窘迫、早產(chǎn)、羊水糞染、新生兒窒息等[5]，一旦孕婦診斷ICP，則需每周監(jiān)測肝功能，了解總膽汁酸指標(biāo)變化情況，對胎兒監(jiān)護(hù)方法包括計(jì)數(shù)胎動(dòng)、胎兒電子監(jiān)護(hù)、血流頻譜、胎兒超聲，上述方法臨床上普遍應(yīng)用于預(yù)測圍生兒不良結(jié)局[6]，但其作用仍有局限性。目前，無治愈ICP的特效藥，藥物只是用于改善皮膚瘙癢癥狀或者ICP的血清生化指標(biāo)。因此對于ICP早診斷從而加強(qiáng)監(jiān)護(hù)，適時(shí)終止妊娠為目前最有效的處理方案[7]。

3.1 IL-6在各組胎盤組織中的定位及表達(dá)

IL-6由活化的B細(xì)胞、靜止的T細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，是一種多向性細(xì)胞因子，具廣泛的生物學(xué)活性，比如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、調(diào)控免疫防御、炎性反應(yīng)等[8]。IL-6在妊娠、分娩以及胎兒生長發(fā)育中均有重要作用，正常妊娠時(shí)，IL-6維持在較低水平，調(diào)節(jié)胎盤組織的正常功能[9]。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)ICP患者血清中IL-6的表達(dá)明顯高于正常妊娠，且隨著病情的加重該指標(biāo)表達(dá)顯著增強(qiáng)。本研究顯示：IL-6定位在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞漿，IL-6在對照組、ICP輕度組、ICP重度組產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽性表達(dá)率呈顯著遞增趨勢，這一結(jié)果與上述報(bào)道一致。

3.2 STAT3在各組胎盤組織中的定位及表達(dá)

STAT3在很多組織中發(fā)揮重要功能，是細(xì)胞生長過程中的調(diào)節(jié)者[12-13]。Knofler[14]的研究顯示STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活性與絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡遷移和侵襲相關(guān)。有研究[15]對STAT3靶基因Fga、Fgb、Fgg和Socs3的mRNA表達(dá)進(jìn)行了分析，推測抑制STAT3信號通路可能起到關(guān)鍵的抗炎作用，對抗膽汁淤積。本研究顯示：STAT3定位在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞漿和胞核中。STAT3在對照組、ICP輕度組、ICP重度組產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的陽性表達(dá)率呈顯著遞增趨勢，提示STAT3可能參與了ICP的發(fā)生發(fā)展。

3.3 STAT3與IL6的相關(guān)性

IL-6是一種多效應(yīng)的炎癥細(xì)胞，能調(diào)控多種急性期反應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄[16]，IL-6可通過JAK-STAT3信號通路[17]發(fā)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，STAT3經(jīng)磷酸化入核，調(diào)控下游靶基因[18]，參與機(jī)體的炎癥和免疫應(yīng)答。STAT3為IL-6信號傳遞中的急性期反應(yīng)因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、分化中起著至關(guān)重要的作用。針對于STAT3的各種細(xì)胞因子的信號通路研究很多，其存在于細(xì)胞質(zhì)中，被細(xì)胞因子激活后進(jìn)入細(xì)胞核中，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化，或促使細(xì)胞凋亡[19]。王斯南等[20]通過免疫組織化學(xué)法評價(jià)膽酸對IL-6/STAT3通路的激活情況。結(jié)果顯示：膽酸可通過誘導(dǎo)腸道低度炎性反應(yīng)激活I(lǐng)L-6/STAT3通路。目前未見有關(guān)于IL-6/STAT3信號通路在ICP發(fā)病發(fā)展中的研究。本研究顯示：IL-6與STAT3蛋白的表達(dá)于ICP組中呈正相關(guān)，IL-6高表達(dá)可能激活了STAT3表達(dá)，而且隨著病情進(jìn)展，表達(dá)水平越高。提示ICP的發(fā)生發(fā)展可能有IL-6/STAT3信號通路的參與，并有共同促進(jìn)作用，IL-6、STAT3的表達(dá)可能與病情進(jìn)展及不良妊娠結(jié)局有關(guān)。因此，可通過監(jiān)測血清中IL-6及STAT3濃度了解ICP病情嚴(yán)重程度，為臨床指導(dǎo)終止妊娠時(shí)機(jī)提供新的參考指標(biāo)，而從信號通路水平研究ICP發(fā)病原因并為評估該病的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路，但是本研究的樣本數(shù)有限，仍需大樣本、隨機(jī)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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