唐濤　周威　晏姣　戴清香　譚顯勝　金晨鐘　胡軍和

摘要 目前，類雌激素農(nóng)藥對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人口健康造成的危害日益受到人們的關(guān)注。類雌激素農(nóng)藥會(huì)影響雌性哺乳動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致生殖和發(fā)育方面的畸形。本文就類雌激素農(nóng)藥的概念及其對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的毒性作用，并著重從咪鮮胺的類雌激素作用機(jī)制、檢測(cè)方法和今后研究趨勢(shì)3個(gè)方面進(jìn)行闡述，以期對(duì)于同行研究類雌激素農(nóng)藥對(duì)哺乳動(dòng)物生殖毒理方面的研究有一定借鑒意義。

關(guān)鍵詞 類雌激素農(nóng)藥;咪鮮胺;哺乳動(dòng)物;生殖毒理

中圖分類號(hào) S481.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）08-0223-03

農(nóng)藥是廣泛應(yīng)用于害蟲和病害控制的主要化學(xué)品，僅就農(nóng)業(yè)用途而言，歐盟每年使用殺蟲劑超過14萬t，大量應(yīng)用殺蟲劑會(huì)引起人們對(duì)農(nóng)藥危害人類健康的擔(dān)憂，如生殖安全的擔(dān)心，包括目前人類不孕發(fā)病率的逐年，上升也與之相關(guān)。為了提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，農(nóng)藥被人們長(zhǎng)期和大量使用”，對(duì)環(huán)境造成十分嚴(yán)重的污染，特別是有些農(nóng)藥中含有類似雌激素的成分，可能影響動(dòng)物甚至人的內(nèi)分泌功能。

咪鮮胺是一種新型咪唑類高效廣譜殺菌劑2，通用名為Prochloraz，又叫卜菌唑、撲霉唑，具有觸殺性和內(nèi)吸性，通過抑制麥角幽醇的生物合成，從而破壞菌體細(xì)胞膜功能而起作用”。研究表明，咪鮮胺在體外引發(fā)多種作用機(jī)制，因?yàn)樗卓剐奂に睾痛萍に厥荏w，并抑制芳香酶活性。總之咪鮮胺是一種類雌激素農(nóng)藥，其有關(guān)的干擾內(nèi)分泌作用機(jī)制、檢測(cè)技術(shù)和今后研究方向方面的論述還不是很系統(tǒng)。因此，本文就咪鮮胺對(duì)于哺乳動(dòng)物生殖毒理方面的研究予以綜述，期望對(duì)該領(lǐng)域今后的研究有一定的意義。

1咪鮮胺的類雌激素作用機(jī)制的研究

類雌激素農(nóng)藥咪鮮胺也是一種內(nèi)分泌干擾物（endocrinedisruptingchemicals，EDCs），能夠干擾正常內(nèi)分泌激素生物合成4。許多EDCs具有類似雌激素活性并干擾由雌激素受體（estrogenreceptors，ER）介導(dǎo)的正常雌激素信號(hào)傳導(dǎo)作用5。EDCs可以通過與ER直接作用，間接通過芳香烴受體等轉(zhuǎn)錄因子或通過調(diào)節(jié)對(duì)正常雌激素合成和代謝至關(guān)重要的代謝酶，來調(diào)節(jié)和修飾基因組和非基因組ER的活性，從而影響雌激素的功能。雖然受體結(jié)合內(nèi)源性雌激素17β一雌二二醇（Estrogen2，E2），具有相似的親和力，但許多外源性配體已顯示出對(duì)ER的選擇性間。通常，EDCs通過多種機(jī)制起作用，包括通過激活其他轉(zhuǎn)錄因子，最顯著的是芳香烴受體的間接作用，或通過雌激素代謝的修飾。具有上述類似雌激素功能，并且干擾正常內(nèi)分泌功能的農(nóng)藥稱之為類雌激素農(nóng)藥，目前使用比較廣泛67。

某些類雌激素農(nóng)藥與激素有類似的化學(xué)構(gòu)象，可以和激素受體直接結(jié)合，形成配體受體復(fù)合物，復(fù)合物再結(jié)合到細(xì)胞核DNA結(jié)合域的雌激素反應(yīng)元件上，誘導(dǎo)或抑制有關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的靶基因的轉(zhuǎn)錄8。而某些物質(zhì)可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雄激素受體，雖然二者結(jié)合后無生理活性，但由于該類物質(zhì)占據(jù)了正常激素的結(jié)合位點(diǎn)，使之無法與受體結(jié)合從而減弱了正常的激素效應(yīng)四。咪鮮胺是羊毛甾醇14a一脫甲基酶（lanosterol14a-demethylase或CYP51A1）的抑制劑，它是從羊毛甾醇中生產(chǎn)麥角甾醇（真菌細(xì)胞膜的必需成分）所必需的，而羊毛甾醇14x一脫甲基酶是一種細(xì)胞色素P450酶，參與羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為4，4-二甲基膽甾醇-8（9），14，24-三烯-3B-醇。

咪鮮胺有較弱的抗雄激素活性，能夠拮抗外周雄激素受體，減緩雄激素依賴性組織的生長(zhǎng)發(fā)育;還能夠拮抗中樞雄激素受體，阻斷睪酮負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，引起腦垂體促黃體生成素分泌增多叫。類雌激素農(nóng)藥對(duì)男性的影響尤為突出，表現(xiàn)為性腺發(fā)育不良、生殖道腫瘤和先天畸形增多。

因此，咪鮮胺也是一種新型內(nèi)分泌干擾物，主要拮抗相關(guān)生殖激素受體發(fā)揮作用，因?yàn)樗l(fā)雙重作用機(jī)制并且通過阻斷雄激素受體和抑制胎兒類固醇生成起到抗雄激素的作用。體內(nèi)咪鮮胺通過降低生殖器官的重量，影響前列腺中雄激素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)和增加促黃體激素水平素。

2農(nóng)藥咪鮮胺類雌激素作用的檢測(cè)方法

2.1整體動(dòng)物試驗(yàn)

一般整體動(dòng)物試驗(yàn)是通過動(dòng)物試驗(yàn)研究相關(guān)農(nóng)藥受試物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖功能和發(fā)育過程的影響，預(yù)測(cè)其可能產(chǎn)生的對(duì)生殖細(xì)胞、受孕等的不良影響。對(duì)于雌性動(dòng)物的測(cè)試，較經(jīng)典的方法有子宮增重試驗(yàn)1和陰道細(xì)胞角化試驗(yàn);此外，還有過氧化物酶活力測(cè)定8及子宮血管滲透性試驗(yàn)凹。體內(nèi)試驗(yàn)的關(guān)鍵在于選擇合適的試驗(yàn)動(dòng)物和易于檢測(cè)的生理指標(biāo)。如魚類卵黃蛋白原誘導(dǎo)試驗(yàn)，就是根據(jù)正常雄性體內(nèi)不會(huì)含有卵黃蛋白原，在大劑量人工雌激素作用下以及在低劑量類雌激素長(zhǎng)期作用下，都能誘導(dǎo)體內(nèi)卵黃蛋白原的生成，從而檢測(cè)經(jīng)類雌激素農(nóng)藥作用后的雄魚體內(nèi)的卵黃蛋白原的含量來評(píng)價(jià)其毒性。有研究者提出一套將日本青鏘胚胎和幼魚暴露于排放污水中，通過對(duì)暴露后的胚胎損壞死亡情況、孵化率、孵化時(shí)間、幼魚畸形、平游失敗率、生長(zhǎng)（體重、體長(zhǎng)）、性別比率和死亡率等指標(biāo)進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，從而評(píng)價(jià)排放污水的毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的方法。

總之，雖然體內(nèi)試驗(yàn)法的結(jié)果可靠，但是要求大量的動(dòng)物毒理學(xué)試驗(yàn)，需要以犧牲大量的試驗(yàn)動(dòng)物為代價(jià)，并且花費(fèi)大量的人力物力，而且持續(xù)周期較長(zhǎng)。同時(shí)，不同種類的試驗(yàn)動(dòng)物，不同生長(zhǎng)階段的同一種試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)同一類雌激素農(nóng)藥均可能表現(xiàn)出不同的試驗(yàn)結(jié)果。因此，經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)法得出的結(jié)論也有一定的局限性。

2.2離體細(xì)胞試驗(yàn)方法

乳腺癌細(xì)胞7細(xì)胞（breastcancercells，MCF-7）來源于人乳腺癌細(xì)胞，其雌激素受體表達(dá)陽性，具有雌激素依賴性，并在暴露于雌激素化學(xué)物質(zhì)后迅速增殖，廣泛應(yīng)用于類雌激素農(nóng)藥活性的評(píng)價(jià)2。因此，通過雌激素受體（ER）依賴性MCF-7細(xì)胞增殖試驗(yàn)可以檢測(cè)農(nóng)藥的雌激素活性2。具體的操作方法如下：將MCF-7細(xì)胞接種在含有細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育24h后，用試驗(yàn)培養(yǎng)基（含有待檢測(cè)物質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液）代替原有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6d，然后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，從而研究其添加物對(duì)于MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。另外，還可以檢測(cè)其對(duì)照組和不同試驗(yàn)組培養(yǎng)液中雌激素水平的變化，最終決定其檢測(cè)物質(zhì)的抗雌激素作用強(qiáng)度。

另外，還有E-SCREEN方法，就是試驗(yàn)以利用雌激素對(duì)其靶細(xì)胞的增殖作用作為終點(diǎn)來評(píng)估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的雌激素性，該定量測(cè)定法比較了在沒有雌激素（陰性對(duì)照）和存在17β-雌二醇（陽性對(duì)照）和一系列懷疑是雌激素的化學(xué)物質(zhì)的情況下通過相似的MCF-7細(xì)胞接種物獲得的細(xì)胞數(shù)。目前，研究發(fā)現(xiàn)E-SCREEN測(cè)定法可以用來測(cè)量類雌激素農(nóng)藥對(duì)于生殖方面的影響。具體方法是，用一系列濃度的化學(xué)品或目的樣品處理后，使用E2作為陽性對(duì)照，研究MCF7細(xì)胞的增殖情況。使用該測(cè)定法，發(fā)現(xiàn)多種化合物是雌激素的類似物，如烷基酚、鄰苯二.甲酸酯咪鮮胺等。進(jìn)一步研究顯示，這些化合物可以結(jié)合ER并激活MCF7細(xì)胞中pS2（一種雌激素應(yīng)答基因）的轉(zhuǎn)錄3E-SCREEN這樣的增殖試驗(yàn)可能是高度敏感的，并且結(jié)果可能具有相關(guān)性，因?yàn)樵撓到y(tǒng)利用表達(dá)可能介導(dǎo)雌激素效能的內(nèi)源共激活因子的人源細(xì)胞。最近有研究報(bào)道，利用該技術(shù)進(jìn)行了玉米赤霉烯酮及其衍生物的雌激素活性研究，測(cè)量暴露于這些霉菌毒素的ER陽性人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的增殖，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在6.25～25.00μM水平暴露后，通過使用E-Screen生物測(cè)定評(píng)估細(xì)胞增殖，其結(jié)果顯示了玉米赤霉烯酮及其衍生物在MCF-7細(xì)胞中的雌激素活性0。

2.3分子生物學(xué)方法

熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素為底物檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)，熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，其間會(huì)發(fā)出生物熒光，然后可以通過熒光測(cè)定儀測(cè)定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光07-18?？梢?，熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法"8。目前，按照整個(gè)方法技術(shù)體系，構(gòu)建了雌激素受體亞型介導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，開發(fā)了使用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的人類雌激素受體（hERalpha）和hERbeta介導(dǎo)的報(bào)告基因測(cè)定，結(jié)果hERalpha報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)E2的最低檢測(cè)限為1.9x10-11mol/L，在1.9x10-8mol/L處獲得最高誘導(dǎo)倍數(shù)，是對(duì)照組的30.7倍。

分子生物學(xué)方法快速、靈敏、特異性高，使類雌激素農(nóng)藥體外檢測(cè)試驗(yàn)更易實(shí)現(xiàn)，可操作性強(qiáng)。用其他激素類受體（如雄激素受體、孕激素受體）替代該體系中的雌激素受體，就可以構(gòu)建檢測(cè)環(huán)境雄激素和環(huán)境孕激素的試驗(yàn)體系。因此，該方法的推廣性好。

3今后研究方向

農(nóng)藥殘留弓發(fā)的問題涉及醫(yī)療、飲食建筑、造船、水產(chǎn)養(yǎng)殖等各行各業(yè)021，目前，對(duì)雌激素作用機(jī)制尚不清楚，對(duì)環(huán)境污染物雌激素生物活性的研究還處于探索性研究階段，僅可以根據(jù)有限的試驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè)哪些環(huán)境污染物可能具有雌激素活性，尚無足夠的在人體中負(fù)面效應(yīng)的證據(jù)。因此，類雌激素農(nóng)藥作用機(jī)制的深人研究對(duì)了解和確定一種環(huán)境污染物的雌激素性質(zhì)十分必要。另一個(gè)研究方向即研究更多的化學(xué)品和其他壓力因素及其潛在累積影響。多年來，毒理學(xué)家傾向于避免研究累積效應(yīng)，因?yàn)樗徽J(rèn)為是一個(gè)棘手的問題。對(duì)于激素活性劑來說尤其如此，因?yàn)橛写罅康呐潴w和多種來源，其中不僅包括人造化學(xué)物質(zhì)，還包括植物中的化合物、內(nèi)源性激素，甚至非化學(xué)應(yīng)激物。最后，這方面的未來研究需要不斷拓展，這意味著關(guān)于內(nèi)分泌系統(tǒng)特定組分的信息（例如特定的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)）需要在全身生理學(xué)的背景下進(jìn)行解釋2。

隨著分子生物學(xué)試驗(yàn)方法的滲透、人類基因組計(jì)劃中人類基因圖譜的繪制完善，生物芯片中毒理芯片的研究很快將成為毒理學(xué)研究的前沿2-24，建立科學(xué)準(zhǔn)確的環(huán)境污染物雌激素活性篩選方法、充分利用人類基因組計(jì)劃研究結(jié)果進(jìn)行毒理芯片的研究是最理想的切人點(diǎn)。

4參考文獻(xiàn)

[1] PIMENTEL D. Environmental and economic costs of the application ofpesticides primarily in the United States [J].Environment ， Developmentand Sustainability ，2005，7（2）：229- -252.

[2] PILLING E D， BROMLEYCHALLENOR K A C，WALKER C H，et al.Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide λ- cyhalothrinand the imidazole fungicide prochloraz in the honeybee（ Apis melliferaL. ）[J].Pesticide Biochemistry and Physiology ， 1995 ，51（1）：1-11.

[3] VINGGAARD A M，HASS U， DALGAARD M ，et al.Prochloraz ：an imid-azole fungicide with multiple mechanisms of action[J].International Jour-nal of Andrology ， 2006，29（1）： 186- 192.

[4] DIAMANTI-KANDARAKIS E， BOURGUIGNONJ P，GIUDICE LC，et al. Endocrine- -disrupting chemicals： an Endocrine Society scientific statem-ent[J].Endocrine Reviews， 2009 ， 30（4）：293-342.

[5] Lemaire G， Mnif W ， Mauvais P，et al.Activation of alpha- -and beta- estrogenreceptors by persistent pesticides in reporter cell lines[J].Life Sciences，2006，79（12）：1160-1169.

[6] VANDENBERG L N ，COLBORN T，HAYES T B，et al.Hormones andendocrine - disrupting chemicals： low -dose effects and nonmonotonicdose responses[J].Endocrine Reviews，2013， 33（3）：378- -455.

[7] BAUMANN L， KNORR S， KEITER S， et al.Prochloraz causes irreversiblemasculinization of zebrafish （ Danio rerio ）[J].Environmental Science andPollution Research，2015 ， 22（21）：16417- 16422.

[8] SEEGER B， KLAWONN K， BEKALE B N，et al.Mixture effects of estro-genic pesticides at the human estrogen receptor a and B[J].Plos One ，2016，11（1）：e0147490.

[9] HOFMEISTER M V， BONEFELD-JERGENSEN E C.Effcts of the pest-icides prochloraz and methiocarb on human estrogen receptor and mRNAlevels analyzed by on-line RT-PCR[J].Toxicology in Vitro，2004，18（4）：427-433.

[10] LEPESHEVA GI， WATERMAN M R.Sterol 14- -demethylase cytochromeP450（CYP51），a P450 in all biological kingdoms[J].Biochimica et Bio-physica Acta（ BBA ）-General Subjects ， 2007， 1770（3）：467-477.

[11] VINGGAARD A M，NELLEMANN C，DALGAARD M ，et al.Antiandro-genic effects in vitro and in vivo of the fungicide prochloraz[J].Toxicolo-gical Sciences ， 2002 ， 69（2）：344-353.

[12] OKUBOT，SUZUKI T， YOKOYAMA Y ，et al.Estimation of estrogenic andantiestrogenic activities of selected pesticides by MCF-7 cell proliferationassay[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology ，2004，46（4）：445- -453.

[13] SOTO A M， SONNENSCHEIN C，CHUNG K L，et al.The E- SCREENassay as a tool to identify estrogens： an update on estrogenic environm-ental pollutants[J].Environmental Health Perspectives， 1995， 103（Suppl7）：113. .

[14] BITSCH N，DUDAS C， KORNER W，et al.Estrogenic activity of muskfragrances detected by the E-screen assay using human mcf-7 cells[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology ， 2002 ，43（3）：257-264.

[15] LANGE C， KUCH B， METZGER J W Estrogenic activity of constituentsof underarm deodorants determined by E -Screen assay[J].Chemosphere，2014， 108： 101-106.

[16]TATAY E，ESPIN S，CARCIA-FERNANDEZ A J，et al.Estrogenic act-ivity of zearalenone ， a - zearalenol and β - zearalenol assessed using theE- screen assay in MCF-7 cells[J].Toxicology Mechanisms and Methods，2018 ， 28（4）：239- -242.

[17] RAMANATHAN C，LIU A C.Developing mammalian cellular clock mo-dels using firefly luciferase reporter ， in reporter gene assays[J].ReporterGene Assays，2018， 1755 ：49-64.

[18] VAN VUGT-LUSSENBURG B M A，VAN DER LEEA R B，MANH Y，et al.Incorporation of metabolic enzymes to improve predictivity of repo-rter gene assay results for estrogenic and anti- -androgenic activity[J].Re-productive Toxicology ，2018，75：40- -48.

[19]LIU Y，HUANG X M， QU SJ，et al.Estrogen receptor subtype- -mediatedluciferase reporter gene assays for determining （ anti ）estrogen effect ofchemicals[J].Journal of Sichuan University （ Medical Science Edition），2015，46（6）：811-815.

[20] WANG W L，TADA M， NAKAJIMA D， et al.Multi-parameter phenoty-pic profiling in MCF-7 cells for assessing the toxicity and estrogenicactivity of whole environmental water[J].Environmental Science & Tech-nology ，2018，52（ 16）：9277-9284.

[21] DOMINGUES I，OLIVEIRA R， MUSSO C，et al.Prochloraz efcts onbiomarkers activity in zebrafish early life stages and adults[J].Environm-ental Toxicology ，2013 ，28（3）：155-163.

[22] MA L， YATES S R.Dissolved organic matter and estrogen interactionsregulate estrogen removal in the aqueous environment ：a review[J].Scie-nce of the Total Environment ， 2018 ， 640：529- -542.

[23] MA Dongfang， HUANG Shi ， ZHANG Peng， et al.Sensitivity of fusariumgraminearum to carbendazim and prochloraz[J].Plant Diseases & Pests ，2017 ， 8（1）：21-23.

[24] XU Chengxiang， MA Yanping， LIU Haobin.Preservation effect of proch-loraz - manganese chloride complex on postharvest ' Shatangju' （ Citrusreticulata ）fruits[J.Plant Diseases and Pests ，2016，7（5/6）：32.