李海劍 張婷婷

1河南省食品藥品審評查驗(yàn)中心 （河南 鄭州 450003）2河南省食品藥品檢驗(yàn)所 （河南 鄭州 450003）

內(nèi)容提要： 建立膠乳增強(qiáng)免疫比濁測定血清視黃醇結(jié)合蛋白的全自動分析方法。采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁測定視黃醇結(jié)合蛋白，測定其準(zhǔn)確度、線性、精密度等，并與同類產(chǎn)品對比測定臨床樣本。此方法批內(nèi)精密度CV值為2.3%；批間相對極差為3.5%。線性范圍可達(dá)140mg/L。與其他相關(guān)試劑比較γ=0.999。本試劑方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，線性范圍寬，穩(wěn)定，價(jià)格低廉，完全可用于檢測臨床標(biāo)本。

視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）是體內(nèi)一類將視黃醇從肝中轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織以及實(shí)現(xiàn)視黃醇的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的特異性的運(yùn)載蛋白[1]。以視黃醇和蛋白結(jié)合的形式存在，一旦復(fù)合物中的視黃醇和靶細(xì)胞結(jié)合，極有可能導(dǎo)致RBP和蛋白分離，由腎小球?yàn)V出或腎小管細(xì)胞吸收。測定RBP的含量，對肝臟、腎臟及營養(yǎng)狀況等疾病的診斷和治療有著重要意義[2,3]。目前臨床上，RBP檢測有以下方法：放射免疫分析法、免疫電泳法酶聯(lián)免疫吸附分析法和免疫比濁法[4-6]。本文建立的是膠乳免疫比濁法，通過把抗體包被到膠乳顆粒上配制成液體試劑，將免疫學(xué)方法很好地運(yùn)用到全自動生化分析儀上，是一種方便實(shí)用高效的自動化分析方法。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試劑：①試劑R1：磷酸鹽緩沖液。②試劑R2：磷酸鹽緩沖液、包被抗人RBP抗體乳膠顆粒懸液。③對照試劑：市銷RBP試劑盒（膠乳免疫比濁法)。④參考品：參考品1，3.0mg/L；參考品2，138.8mg/L。

儀器設(shè)備：日立全自動生化分析儀。

1.2 方法

終點(diǎn)法，波長600nm，反應(yīng)溫度37°C，標(biāo)本3μL，試劑Rl 225μL，試劑R2 75μL，反應(yīng)時(shí)間300s。

表1.準(zhǔn)確度測定結(jié)果

2.結(jié)果

2.1試劑Rl緩沖液確定

選三種緩沖液實(shí)驗(yàn)，其他條件不變，測定138.8mg/L參考品，Tris緩沖液結(jié)果在參考品值范圍內(nèi)但明顯偏高；枸櫞酸緩沖液結(jié)果不在參考品值范圍內(nèi)。磷酸鹽緩沖液結(jié)果接近參考品且重復(fù)性很好，故選用磷酸鹽緩沖液。

2.2磷酸鹽緩沖液pH的確定

選五種不同pH（pH6.2、6.8、7.2、7.8、8.2）磷酸鹽緩沖液實(shí)驗(yàn)，其他條件不變，測定138.8mg/L參考品，pH低時(shí)測定結(jié)果偏低，pH高時(shí)結(jié)果偏高，pH7.2時(shí)結(jié)果最為理想，故磷酸鹽緩沖液pH確定為7.2。

2.3試劑R2包被抗人RBP抗體乳膠顆粒懸液最佳濃度選擇

選5種不同包被抗人RBP抗體膠乳顆粒懸液濃度（0.05、0.10、0.15、0.2、0.25mL/L）實(shí)驗(yàn)，其他條件不變，測定138.8mg/L參考品，濃度低時(shí)測定結(jié)果偏低，濃度高時(shí)結(jié)果偏高，濃度為0.15mL/L時(shí)結(jié)果最為理想，故試劑R2包被抗人RBP抗體乳膠顆粒懸液最佳濃度0.15mL/L。

2.4準(zhǔn)確度

測定參考品1、2，重復(fù)檢測3次，取均值，計(jì)算相對偏差，見表1。

2.5精密度確定

測定參考品138.8mg/L重復(fù)10次，計(jì)算均值及精密度，其結(jié)果批內(nèi)精密度CV為2.3%；批間相對極差為3.5%。

2.6線性范圍測定

用接近線性區(qū)間下限的樣品稀釋接近線性區(qū)間上限的高濃度樣品，得5個(gè)稀釋濃度，每個(gè)濃度測試3次，取平均值進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明在140mg/L時(shí)線性良好，見表2。回歸方程：y(測定值)=1.0633x(理論值)-2.2078，相關(guān)系數(shù)為0.9991。

表2.線性測定結(jié)果(mg/L)

2.7 方法學(xué)評價(jià)

研發(fā)試劑和對比試劑雙份測定42份樣本，計(jì)算P和相關(guān)系數(shù)r。結(jié)果P=0.34（＞0.05），兩種檢測結(jié)果的量值無顯著性差異；r=0.999（＞0.975），兩組測試數(shù)值具有顯著性正線性相關(guān)關(guān)系。

2.8 試劑穩(wěn)定性觀察

試劑置2～8°C保存，0、1、2、6、12、13個(gè)月各檢測一次，其準(zhǔn)確度、批內(nèi)精密度、線性等均無明顯變化。

3.討論

本試劑采用膠乳免疫比濁法，將RBP抗體吸附于膠乳顆粒表面，樣本中的RBP與膠乳顆粒上吸附的抗體結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生濁度變化，該濁度變化的高低與樣本中RBP的含量成正比。通過測定600nm處吸光度的變化，即可得出RBP的含量。

該方法僅在全自動生化分析儀上就可以進(jìn)行測定，操作簡單，無需其他特殊的設(shè)備，線性范圍較寬，準(zhǔn)確度高，較穩(wěn)定等，是RBP理想的測定方法[7]。