楊遲暉， 張 晶， 孟磊俊， 宮麗平， 常 慶， 張 泓， 曾乃燕

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院檢驗(yàn)科，上海 201801；3.上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040；4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100054；5.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 201800）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，我國(guó)女性近年來發(fā)病率更明顯增加，以平均每年20.1%的速度上升，在最常見癌癥中位于第5位[1]。甲狀腺癌病理分類主要為分化型甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌、低分化型甲狀腺癌和未分化甲狀腺癌。其中，分化型甲狀腺癌包括乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer,PTC），其約占甲狀腺癌的84%；以及濾泡狀甲狀腺癌，約占甲狀腺癌的11%[2-3]。不同類型的甲狀腺癌，其生物學(xué)特性、臨床表現(xiàn)、診斷、治療及預(yù)后均有所不同。甲狀腺癌的傳統(tǒng)治療方法包括甲狀腺切除、放射性碘治療和術(shù)后長(zhǎng)期促甲狀腺激素抑制治療[4]。通常濾泡上皮來源的甲狀腺癌（如PTC）有比較好的療效和生存率，但其中有小部分甲狀腺癌惡性程度很高，表現(xiàn)為局部侵襲、容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。一旦發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，患者的10年生存率可從85%～92%下降為10%～40%[5-6]。

近年來，分子水平的研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌特征性基因改變包括原癌基因突變 （如BRAF和RAS基因等）和染色體重排基因突變 （如RET/PTC1、RET/PTC3和PAX8/PPARG等），因此甲狀腺癌分子發(fā)病機(jī)制可能涉及多種信號(hào)通路 （如MAPK和PI3K/AKT等），其中以BRAF突變最為常見[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E突變存在于大多數(shù)典型的PTC和幾乎所有的鞋釘型PTC中，但不存在于未分化甲狀腺癌和低分化型甲狀腺癌中[9]。BRAF V600E突變可能與甲狀腺癌的原發(fā)腫瘤腺外侵襲、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)、高分期等侵襲性腫瘤特征相關(guān)，但與腫瘤復(fù)發(fā)間的相關(guān)性仍有爭(zhēng)議[10-15]。

鑒于目前對(duì)于甲狀腺癌的分子機(jī)制尚不明確，臨床上缺乏診斷治療的分子靶點(diǎn)。因此，本研究擬通過靶向二代測(cè)序 （next generation sequencing，NGS），對(duì)比分析52個(gè)實(shí)體瘤相關(guān)基因在石蠟標(biāo)本PTC 組織與癌旁組織（normal adjacent tissue，NAT）中的基因突變，從而鑒定這些病例的腫瘤特異性基因改變。此外，由于NF-κB信號(hào)通路及其目的基因是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳遞途徑的調(diào)控基因，具有控制細(xì)胞周期、凋亡、生長(zhǎng)、組織侵襲性和炎癥發(fā)生的作用，并在很多癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[16-17]，但在甲狀腺癌中的作用和臨床意義研究甚少。本研究通過對(duì)NF-κB目的基因在PTC組織與NAT中的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，探討NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因與PTC發(fā)生、發(fā)展間的相關(guān)性。最后將以上分子水平檢測(cè)結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)結(jié)合，進(jìn)一步分析可用于甲狀腺癌臨床診斷治療的腫瘤特異性分子靶點(diǎn)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集20例2013年在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院接受全甲狀腺切除術(shù)的PTC患者的手術(shù)樣本和臨床數(shù)據(jù)?；颊叩哪挲g在27~68歲之間，平均年齡為（46±13）歲，包括7例男性和13例女性（見表 1）。

表1 患者的基本信息

二、方法

1．標(biāo)本收集：收集術(shù)后石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）的甲狀腺組織，每個(gè)蠟塊切取 4～6片 10 μm厚的切片。經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色的切片由病理醫(yī)師進(jìn)行組織學(xué)鑒定，并標(biāo)記腫瘤區(qū)域。FFPE切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，根據(jù)HE片的標(biāo)記區(qū)域，按文獻(xiàn)[18]的方法分離PTC組織與NAT，分別置于1．5 mL離心管中。

2．核酸提?。喝∩鲜鲭x心管中組織各一半（相當(dāng)于2～3片F(xiàn)FPE組織量），分別用于DNA和RNA提取。使用RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）試劑盒提取FFPE組織中的RNA；用蛋白酶K消化組織后，使用TIANamp FFPE DNA（天根生物，北京）試劑盒進(jìn)行DNA提取。用Qubit 3．0熒光分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定核酸質(zhì)量和純度后，于-80℃下凍存待用。

3．cDNA合成和定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）： 用 DNA-free Kit DNase Treatment and Removal Reagents（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）處理 RNA中殘留的DNA，用 SuperScript?Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）在 20 μL 反應(yīng)體系中 （詳細(xì)參見試劑說明書）進(jìn)行cDNA合成。以PPIA作為內(nèi)參基因，對(duì)10個(gè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物設(shè)計(jì)詳見表2，序列由上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體積為10 μL，包括 2× SsoFast Evagreen Supermix （BioRad，美國(guó)）5 μL，cDNA 模板 1 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0．2 μL，無核酸酶水 3．6 μL。 以無 DNA 模板的反應(yīng)體系（只加無核酸酶水）作為陰性對(duì)照。所有樣品進(jìn)行雙孔復(fù)孔檢測(cè)，取循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct）的平均值，用靶基因與內(nèi)參基因的比值（ΔCt）來計(jì)算每個(gè)靶基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為，95℃30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，共 40～50 個(gè)循環(huán)；熔解曲線為 95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。

4．免疫組織化學(xué) （免疫組化）：FFPE組織切取3 μm厚的白片，按照參考文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、抗體孵育和顯色。CD44抗體（15675-1-AP，1∶200）、Cyclin D2 抗體 （10934-1-AP，1∶200）和 Bcl-2 抗體 （12789-1-AP，1∶100） 購自日本 Proteintech公司。由病理醫(yī)師在顯微鏡下根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)估蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果用無表達(dá)（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）表示。 用寧波江豐公司KF-pro-005掃描儀在40倍鏡下進(jìn)行全片掃描，獲得數(shù)字圖像并保存。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

5．靶向NGS和數(shù)據(jù)分析：采用美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司Oncomine Focus Assay試劑盒，對(duì)隨訪發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及DNA提取質(zhì)量高的1號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、10號(hào)和16號(hào)病例成對(duì)的PTC和NAT的DNA進(jìn)行測(cè)序分析，并對(duì)PTC組織混合樣品（即不包含2號(hào)和6號(hào)的混合樣本）和NAT混合樣品 （即不包含2號(hào)、6號(hào)、11號(hào)、15號(hào)和18號(hào)的混合樣本），以及有轉(zhuǎn)移的周圍淋巴結(jié)混合樣本（即為2號(hào)、6號(hào)、11號(hào)和13號(hào)的混合樣本）和無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)混合樣本（即為2號(hào)、6號(hào)和11號(hào)的混合樣本）進(jìn)行比較分析。主要步驟包括文庫構(gòu)建、模板制備及上機(jī)測(cè)序。以20 ng DNA為起始模板進(jìn)行擴(kuò)增建庫。用AMPure XP Reagent（Beckman Coulter，美國(guó)）純化后，用 Ion Library TaqMan Quantitation Kit試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，將產(chǎn)物稀釋至50 pmol/L，置于Ion Chef（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）上進(jìn)行模板制備后，將制備好的Ion 520芯片置于Ion S5測(cè)序儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）中進(jìn)行測(cè)序，在 Ion Reporter（https：//ionreporter．thermofisher．com）上以人類基因19為參考基因并按“Oncomine Focus-520-w2．3-DNA-Single Sample” 工作程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用等位基因突變頻率≥1%的篩選模式，篩選的基因異常包括小片段插入或刪除、錯(cuò)義突變、未翻譯區(qū)變異（untranslated regions variants，UTR）和剪接位點(diǎn)變異。

6．實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （real-time quantitative PCR，qPCR）檢測(cè)BRAF V600E突變：用武漢友芝友醫(yī)療科技公司 “人類基因V600E突變檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）”對(duì)17例病例FFPE組織提取的DNA中的V600E突變進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣本在2個(gè)反應(yīng)管中分別進(jìn)行BRAF V600E反應(yīng)和質(zhì)控反應(yīng)的檢測(cè)（按試劑盒說明書操作）。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為，當(dāng) V600E PCR 反應(yīng)的 Ct值＜38，且 ΔCt（V600E PCR Ct值與質(zhì)控PCR Ct值的差值）＜9時(shí)，認(rèn)為該樣本有V600E突變；當(dāng)V600E PCR Ct值≥38或無Ct值時(shí)，認(rèn)為該樣本無V600E突變。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過t檢驗(yàn)對(duì)NF-κB目的基因在癌組織和NAT中的表達(dá)進(jìn)行比較，P＜0．05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因在PTC及NAT中的mRNA水平表達(dá)分析

結(jié) 果

一、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因在乳頭狀甲狀腺癌中的異常表達(dá)

20例PTC患者中14例發(fā)生了腫瘤淋巴結(jié)浸潤(rùn)。在5年的隨訪過程中，有5例患者經(jīng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)異常腫大淋巴結(jié)，定義為復(fù)發(fā)，其中2例經(jīng)再次接受手術(shù)，并經(jīng)病理證實(shí)為PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（見表 1）。

通過qRT-PCR成對(duì)分析了20例患者PTC和NAT中的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平，包括 NF-κB 目的基因 IRF4、BCL2、CD44、c-FLIP、CCND2、IκBα、A20 及 ABIN 家族基因（ABIN-1、ABIN-2、ABIN-3），其中A20及ABIN家族同時(shí)也是NF-κB信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控基因。結(jié)果顯示，PTC中的 CD44、CCND2 表達(dá)量顯著高于 NAT （P＜0．05）；而PTC中的BCL2表達(dá)量有低于NAT的趨勢(shì)，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他基因的表達(dá)水平在PTC與NAT間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。此外，分析結(jié)果表明，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC間，各NF-κB目的基因的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖 2）。

對(duì)于在mRNA水平上有明顯變化的基因，進(jìn)一步在蛋白水平上進(jìn)行免疫組化分析。由于甲狀腺腫瘤體積小，其中9例在完成RNA表達(dá)檢測(cè)后無剩余組織可供免疫組化分析。對(duì)其他11例樣本（7例男性和4例女性）的免疫組化分析結(jié)果顯示，PTC中的CD44及Cyclin D2表達(dá)量明顯高于NAT，在PTC中其表達(dá)為強(qiáng)陽（+++），而在NAT中表達(dá)為弱陽（+）。其中2例病例的PTC中，BCL2無表達(dá)或呈弱陽性（-/+），而在其NAT中表達(dá)為陽性或強(qiáng)陽性（++/+++）；1例的 PTC中 BCL2表達(dá)量明顯高于NAT；而在另8例中，PTC與NAT間的BCL2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表3、圖3）。因此，免疫組化分析結(jié)果顯示，在PTC組織中CD44和Cyclin D2的表達(dá)顯著升高，與其mRNA水平結(jié)果一致；在部分病例PTC組織中BCL2的表達(dá)低于NAT，但在蛋白和mRNA水平上其差異表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PTC組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)分析

表3 免疫組化分析檢測(cè)CD44、Cyclin D2和BCL2蛋白在PTC和NAT中的表達(dá)

二、對(duì)比鑒定乳頭狀甲狀腺癌的腫瘤特異性基因變異

對(duì)1號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、10號(hào)和16號(hào)病例，以及混合的PTC樣本和混合的淋巴結(jié)樣本的PTC組織和NAT進(jìn)行52個(gè)實(shí)體瘤靶向基因的NGS分析。結(jié)果顯示，ALK、BRAF、FGFR4和 KIT在所有 5個(gè)病例中都有突變，MYC和FGFR3在4個(gè)病例中有突變，CTNNB1、DDR2、EGFR、ERBB3 和 HRAS 在 3 個(gè)病例中有突變。GNA11在1號(hào)和8號(hào)中存在突變；7個(gè)基因在單一的病例中檢測(cè)到突變。在混合的PTC樣本（PTC和NAT）中檢測(cè)到的突變基因包括ALK、BRAF、FGFR4、KIT、MYC 和 MET。 在混合的淋巴結(jié)樣本中同樣存在 ALK、BRAF、FGFR4、KIT和MYC基因突變，另外還檢測(cè)到DDR2基因突變，但未檢測(cè)到MET基因突變（見圖4）。

圖3 CD44、Cyclin D2及BCL2蛋白在PTC與NAT中的表達(dá)

對(duì)每個(gè)基因的具體突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ALK基因突變主要為 D1529E （rs1881421）和I1461V （rs1670283），都同時(shí)存在于PTC和NAT中，因此屬于胚系突變；而8號(hào)病例PTC組織中檢測(cè)到2個(gè)位于剪接位點(diǎn)的ALK點(diǎn)突變，分別是splisite_3’c．3450+1G＞A 和 splisite_5’c．3360-1G＞A，但在該病例的NAT中沒有檢測(cè)到，因此為腫瘤特異性突變，即體細(xì)胞突變。在各病例中檢測(cè)到的FGFR4 基因突變都基本為 P136L （c．407C＞T，rs376618），該突變屬于胚系突變。KIT基因在5號(hào)、10號(hào)、16號(hào)、混合的PTC樣品和混合的淋巴結(jié)樣品中均檢測(cè)到屬于胚系突變的插入突變 （c．67+4951T＞TA,rs11407544）；而在8號(hào)病例的PTC組織中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)剪接位點(diǎn)突變（splicesite_5’c．1648-1G＞A,rs121913234），在 NAT 中未發(fā)現(xiàn)，為體細(xì)胞突變；此外，5號(hào)和8號(hào)病例中還存在其他點(diǎn)突變，如 G424S、A502T、Q514K、V559A、T574I、D579N、V643I和A814T等，均為體細(xì)胞突變。MYC基因在4個(gè)病例和混合的淋巴結(jié)的PTC和NAT中都檢測(cè)到 了 3’UTR 區(qū) 域 的 點(diǎn) 突 變 (c．1415A ＞G,rs2070583)，為胚系突變；然而只在混合的PTC樣品中有點(diǎn)突變（c．1415A＞G,rs2070583），為體細(xì)胞突變；5號(hào)病例的T73I突變?yōu)轶w細(xì)胞突變。FGFR3在1號(hào)病例中的G90V和8號(hào)病例中的N718S突變?yōu)榕呦低蛔?；而?號(hào)和16號(hào)癌組織中的不同點(diǎn)突變（如R640Q和S104F）都屬于體細(xì)胞突變。

NGS結(jié)果顯示，BRAF V600E突變存在于所有病例中，但在5號(hào)、8號(hào)和10號(hào)病例中，僅在其PTC組織中出現(xiàn)（見圖4）。當(dāng)用qPCR方法檢測(cè)V600E突變時(shí)，結(jié)果顯示17個(gè)病例中有14例存在V600E突變，其中9例為體細(xì)胞突變（64%），4例為胚系突變（29%）（見表 4）。這些結(jié)果說明，BRAF V600E 突變?cè)赑TC病例中出現(xiàn)的頻率很高（82%），但并非都是體細(xì)胞突變，也可為胚系突變（見表4）。

圖4 靶向NGS對(duì)比分析PTC和NAT中實(shí)體瘤相關(guān)基因的突變情況

表4 靶向NGS和qPCR對(duì)比分析PTC和NAT中的BRAF V600E基因突變情況

討 論

NF-κB信號(hào)通路主要參與炎癥反應(yīng)，并在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中起重要作用，但在甲狀腺癌的研究中少有提及。因甲狀腺癌可能與其炎癥反應(yīng)有一定聯(lián)系，因此本研究著重對(duì)比檢測(cè)了NF-κB的目的基因及一些調(diào)節(jié)基因在PTC組織與NAT中的表達(dá)水平有無差異，以探討這條信號(hào)通路是否在PTC中起作用。

一、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因在PTC中的表達(dá)及意義

本研究通過qRT-PCR檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)，分析了NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因在PTC患者的腫瘤組織和NAT中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NF-κB目的基因中的CD44和CCND2在PTC組織中的表達(dá)顯著高于NAT。此前，Takano等[20]也在甲狀腺細(xì)針穿刺標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，CD44在甲狀腺癌中的表達(dá)明顯高于正常甲狀腺組織。目前研究認(rèn)為，CD44主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附和連接[21]。CD44可增強(qiáng)乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌等癌細(xì)胞的侵襲性[22-25]，但在PTC中研究很少。而CCND2在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化和惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，CCND2在睪丸癌、結(jié)腸癌、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤中高表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后不良有關(guān)[27-30]；而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及胰腺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)[31]，但在PTC中尚未見任何報(bào)道。

因此，本研究首次對(duì)比分析了NF-κB的重要靶點(diǎn)基因在PTC臨床FFPE樣本的腫瘤組織與NAT中的表達(dá)情況，并首次發(fā)現(xiàn)PTC的發(fā)生、發(fā)展可能與CD44及CCND2基因的異常高表達(dá)相關(guān)。但這2個(gè)基因在PTC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

二、PTC中的BRAF突變檢測(cè)

為全面了解本研究所用PTC病例的分子背景和可能涉及的分子機(jī)制，本研究用NGS詳細(xì)檢測(cè)了與實(shí)體瘤密切相關(guān)的52個(gè)基因的突變情況，這些基因涵蓋了目前研究報(bào)道的在甲狀腺癌中可能起作用的基因。

BRAF突變是甲狀腺癌中被研究最多的分子靶點(diǎn)，據(jù)報(bào)道，在40%～45%的PTC中均可檢測(cè)到BRAF基因突變[32-34]。這種突變還會(huì)導(dǎo)致負(fù)責(zé)碘更新和代謝的基因的表達(dá)減少，從而降低甲狀腺腫瘤對(duì)放射碘治療的反應(yīng)[35-37]。因此，本研究著重對(duì)比分析了BRAF基因突變，尤其是V600E突變?cè)赑TC及NAT中的存在情況。NGS和qPCR檢測(cè)結(jié)果都表明，PTC病例中存在高頻的V600E突變，且并非都是體細(xì)胞突變，也可以是胚系突變。在用NGS和qPCR同時(shí)檢測(cè)V600E的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)2種方法檢出結(jié)果的相符率達(dá)80%；而其差異在于，NGS檢測(cè)到8號(hào)病例PTC組織中的V600E突變未在qPCR檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)；而qPCR檢測(cè)到10號(hào)病例NAT中的V600E未在NGS檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，提示對(duì)于極低豐度突變，NGS和qPCR平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度都受到了很大挑戰(zhàn)，這種情況下兩者同時(shí)檢測(cè)可提高陽性檢出率。

三、PTC中的酪氨酸激酶基因突變檢測(cè)及意義

除了BRAF基因突變?cè)谒胁±?/5）中出現(xiàn)外，MAPK信號(hào)通路的重要基因如 HRAS（3/5）、KRAS（2/5）、NRAS（2/5）及 RET（2/5）的突變也在本研究中高頻出現(xiàn)，提示該信號(hào)通路與PTC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，該通路抑制劑可能適用于靶向治療帶有這些基因突變的PTC患者。另外，一些受體酪氨酸激酶/生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要基因，包括ALK、FGFR4、FGFR3和 KIT， 也在本研究的 5例PTC患者中被檢測(cè)到高頻突變。

ALK基因在多種惡性腫瘤中異常存在。在本研究中檢測(cè)到的2個(gè)ALK基因的胚系突變r(jià)s1881421和rs1670283，在淋巴瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中也有發(fā)現(xiàn)[38]。但8號(hào)病例中2個(gè)位于剪接位點(diǎn)的腫瘤特異性 突 變 （splisite_3’c.3450+1G>A 和 splisite_5’c.3360-1G>A）在以往研究中未見報(bào)道，其在腫瘤中的發(fā)生頻率和臨床意義有待進(jìn)一步研究。

FGFR家族受體在發(fā)育、分化、細(xì)胞存活和細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[39-41]。FGFR4在本研究的單個(gè)病例和混合樣品中都檢測(cè)到突變，但這個(gè)共同的突變 （rs376618）為胚系突變，尚無與疾病相關(guān)的報(bào)道。因此，F(xiàn)GFR4基因在PTC中是否起作用尚待進(jìn)一步研究。在本研究5例患者的4例中檢測(cè)到該家族另一成員FGFR3的點(diǎn)突變，既有胚系突變，也有體細(xì)胞突變，其中N718S為胚系突變，被報(bào)道與乳腺癌有關(guān)[42]。提示FGFR3在PTC腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能起作用，但該基因的具體變異位點(diǎn)存在很大個(gè)體差異，因此在臨床應(yīng)用時(shí)需對(duì)每例患者的具體突變位點(diǎn)進(jìn)行分析鑒定。

KIT可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和生存[43]。臨床發(fā)現(xiàn)KIT突變與黑素瘤、急性白血病及胃腸瘤的發(fā)生密切相關(guān)[44-45]。本研究檢測(cè)到KIT的一個(gè)主要共同突變?yōu)榕呦低蛔冃再|(zhì)的插入突變 （c.67+4951T>TA,rs11407544），目前尚無臨床相關(guān)性的報(bào)道。但在病例8中發(fā)現(xiàn)的剪接位點(diǎn)體細(xì)胞突變（rs121913234），之前曾被報(bào)道可致胃腸道間質(zhì)瘤[46]，并與伊馬替尼或其他KIT抑制劑類藥物的敏感性相關(guān)[43]。另在單獨(dú)病例中還檢測(cè)到KIT基因各種錯(cuò)義突變。因此，提示KIT基因很可能是PTC發(fā)生、發(fā)展中一個(gè)非常重要的作用基因，并在臨床診治中具有指導(dǎo)意義。

上述結(jié)果表明，許多酪氨酸激酶基因在PTC發(fā)生、發(fā)展過程中成為了突變靶點(diǎn)。目前，一些酪氨酸激酶抑制劑可用于治療攜帶這些突變的患者。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了一種多個(gè)靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑——樂伐替尼，用于治療放射性碘難治性分化型甲狀腺癌[47]。因此，以后對(duì)這些基因的臨床檢測(cè)可作為PTC患者個(gè)體化治療的依據(jù)。

四、PTC中的其他重要基因突變及意義

MYC基因編碼一種核磷蛋白，在細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起作用；在子宮內(nèi)膜癌、胃癌及淋巴造血系統(tǒng)都存在MYC的各種突變[48]。本研究大多數(shù)的病例中，其為胚系突變，而其他突變可能是體細(xì)胞突變，但尚無數(shù)據(jù)顯示該突變位點(diǎn)與PTC有關(guān)聯(lián)。而部分病例中發(fā)現(xiàn)的一些錯(cuò)義突變，如T73I，在非霍奇金淋巴瘤、惡性黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、食道癌和惡性淋巴瘤等腫瘤中均有報(bào)道[49]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍作用于PTC細(xì)胞后，可通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）的抑制來降低c-MYC和Cyclin D1的表達(dá)，從而影響甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[50]。可見，MYC基因很可能在PTC進(jìn)程中起作用，而MYC的靶向藥物將來可用于治療攜帶MYC基因突變的甲狀腺癌患者。

此外，在本研究行NGS測(cè)序分析的5例患者中，5號(hào)病例有35個(gè)突變基因，8號(hào)病例有40個(gè)突變基因，數(shù)量遠(yuǎn)多于其他3個(gè)病例，其中有23個(gè)基因突變都僅出現(xiàn)在這2個(gè)病例中。除了在PTC中有報(bào)道過的相關(guān)基因，如 KRAS、HRAS、NRAS、MAP2Ks、PIK3CA、RET 等外， 甚至包括 ERBB2、BRCA1等乳腺癌常見的基因突變，提示這2例患者基因中存在很大的腫瘤負(fù)荷。分析臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，這2例患者均為女性。5號(hào)病例43歲，在甲狀腺手術(shù)1年半后進(jìn)行超聲檢查，發(fā)現(xiàn)有雙側(cè)乳腺低回聲結(jié)節(jié)樣病灶。8號(hào)病例31歲，甲狀腺切除半年后復(fù)發(fā)。這些隨訪結(jié)果和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況說明，這2例患者的腫瘤基因突變負(fù)荷與其不良預(yù)后有關(guān)。提示臨床除了對(duì)單個(gè)藥物靶點(diǎn)基因進(jìn)行檢測(cè)外，還可以通過NGS對(duì)患者的整體腫瘤負(fù)荷進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)行預(yù)后判斷。

總之，本研究結(jié)果提示，PTC患者的BRAF、RAS、ALK、FGFRs、KIT 和 MYC 等基因存在腫瘤特異性突變，此外CD44、CCND2基因高表達(dá)可能與PTC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。臨床檢測(cè)這些基因的突變或表達(dá)情況，將有助于提供精準(zhǔn)治療PTC的分子靶點(diǎn)依據(jù)。此外，同時(shí)利用NGS和qPCR平臺(tái)檢測(cè)可提高BRAF V600E突變的臨床檢出率。但由于本研究的樣本量有限，結(jié)果尚需通過更多病例樣本的檢測(cè)分析來驗(yàn)證和修訂。

致謝：本研究感謝上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院病理科提供的技術(shù)支持；浙江玉安康瑞生物科技有限公司提供的技術(shù)和經(jīng)費(fèi)支持。