李賽玉,曲揚(yáng),萬(wàn)芙,張穎

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.) 為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，資源豐富，在我國(guó)各地均有分布?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明馬齒莧具有抗菌、抗衰老、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[1]。馬齒莧既可藥用，又可食用，是我國(guó)衛(wèi)健委劃定的藥食同源的野生植物之一。

隨著中國(guó)人口老齡化，老年人常見疾病骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)引起廣泛關(guān)注，中國(guó)60歲以上人群骨質(zhì)疏松總體患病率為36%[2]。OP是一種全身代謝性疾病，主要特征骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，可導(dǎo)致骨脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增加。雌激素與骨骼代謝密切相關(guān)，絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平低落，骨吸收與形成不平衡呈脫耦聯(lián)狀態(tài)，即骨質(zhì)吸收增加、骨質(zhì)形成減少，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[3]。目前市面上的抗骨質(zhì)疏松藥物雖然具有確切的預(yù)防或者治療骨質(zhì)疏松的作用，但是長(zhǎng)期服用經(jīng)濟(jì)成本較高，而且可能產(chǎn)生副作用[4-5]。因此，迫切需要尋找安全、有效、價(jià)格合理的防治OP的藥物，更好地克服現(xiàn)有藥物存在的問題。

近期有研究證實(shí)氧化應(yīng)激[6-8]是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要發(fā)病機(jī)制，婦女絕經(jīng)后受衰老和雌激素不足等因素的共同影響，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高，使骨重建失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)病。有研究表明馬齒莧醇浸出物對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的骨丟失起到保護(hù)作用[1]。馬齒莧中總黃酮[9-11]及總多糖[12-14]具有抗氧化及清除自由基的作用。本實(shí)驗(yàn)采用卵巢切除手術(shù)(OVX)模型，研究馬齒莧對(duì)去卵巢小鼠骨代謝的影響及其可能的機(jī)制，為馬齒莧防治骨丟失的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境 昆明小鼠，8周齡，26～30 g，雌性，SPF級(jí)，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(22±1)℃，相對(duì)濕度為30%～65% RH，光照為150～200 Lx，每12 h明暗交替。

1.2 藥品與試劑 馬齒莧(東營(yíng)百佳益中藥飲片有限公司，批號(hào)：151204，產(chǎn)地安徽)；α-硫辛酸(LA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：C1604033)；葡萄糖(天津市大茂化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)許可證號(hào)：XK13-201-00110)；蘆丁(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：150108)；其余試劑均為分析純；堿性磷酸酶(ALP，批號(hào)：20171120)、血清鈣(Ca，批號(hào)：20171120)、磷(P，批號(hào)：20171120)、總膽固醇(TCHO，批號(hào)：20171120)、丙二醛(MDA，批號(hào)：20180110)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：20180105)、總蛋白(TP，批號(hào)：20180110)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 智能高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司，型號(hào)：3H16RI)；酶標(biāo)儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：ST-360)；恒溫?fù)u床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：KYC 1102 Incubator Shaker)；石蠟切片機(jī)(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號(hào)：CN61M/LS-2055)；生物顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：BX51)。

2 方法

2.1 馬齒莧水提物(water extract ofPortulacaoleraceaL.，WEPO)的制備 按藥液比1∶40超聲提取，提取功率100 W，提取時(shí)間30 min。提取完成后，將馬齒莧水提液分別濃縮為0.2 g·mL-1(低劑量)與2 g·mL-1(高劑量)(折合成生藥材的濃度)，備用。

2.2 WEPO中總黃酮和總多糖的含量測(cè)定

2.2.1 WEPO中總黃酮的含量測(cè)定 以蘆丁作為對(duì)照，采用硝酸鋁顯色、紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮的含量。分別將蘆丁的濃度和顯色后的吸光度作為橫軸和縱軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=6.412 5X-0.039 4(r=0.999 5)。將WEPO以該法測(cè)定，得到其黃酮含量分別為0.29 g·L-1和2.9 g·L-1，折合成生藥材含量為1.45 mg·g-1。

2.2.2 WEPO中總多糖的含量測(cè)定 以葡萄糖作為對(duì)照，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總多糖的含量。分別將葡萄糖的濃度和顯色后的吸光度作為橫軸和縱軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=26.15X+0.000 8(r=0.999 9)。WEPO經(jīng)Savage法除蛋白后以該法測(cè)定，得到其多糖含量分別為0.262 g·L-1和2.62 g·L-1，折合成生藥材含量為1.31 mg·g-1。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)選出10只小鼠假手術(shù)(SHAM)和其余40只接受卵巢切除手術(shù)(OVX)。OVX小鼠20%烏拉坦[0.13 mL·(10 g)-1]腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下經(jīng)腰背部雙側(cè)切口，找到子宮，完整切除雙側(cè)卵巢，切口縫合。術(shù)后連續(xù)3 d灌胃羅紅霉素0.003 9 mg·kg-1，防止傷口感染。術(shù)后恢復(fù)5 d后進(jìn)行治療。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為SHAM組(生理鹽水)、模型(OVX)組(生理鹽水)、陽(yáng)性藥組(LA，0.078 g·kg-1)、WEPO低劑量組(生藥2 g·kg-1)、WEPO高劑量組(生藥20 g·kg-1)，各給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物溶液，0.1 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)7周。期間每隔2 d稱重1次并記錄。7周后小鼠摘眼球采血，3 000 rpm離心10 min，分離血清；隨后脫臼處死，摘除胸腺、子宮與脾稱重并記錄；取肝臟用生理鹽水按1∶9制成10%肝勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上層清液。將待測(cè)生物樣本于-80 ℃保存待測(cè)。取兩側(cè)股骨，其中一側(cè)股骨放于10%福爾馬林固定，另一側(cè)股骨稱重并用游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)度。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 血清ALP、Ca、P、TCHO，肝勻漿MDA、SOD、TP按試劑盒說(shuō)明測(cè)定。

2.4.2 骨組織學(xué)分析 骨組織經(jīng)脫鈣、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、脫蠟、染色、透明、封固后，光學(xué)顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 WEPO對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)率的影響 實(shí)驗(yàn)7周，OVX組小鼠體重增長(zhǎng)率顯著高于SHAM組小鼠(P<0.05)。與OVX組比較，WEPO高劑量組的小鼠體重增長(zhǎng)率顯著降低(P<0.05)，WEPO低劑量組、LA組小鼠與OVX組相比體重增長(zhǎng)率有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 小鼠體重增長(zhǎng)率

注：與SHAM組相比，#P<0.05；與OVX組相比，*P<0.05

3.2 WEPO對(duì)OVX小鼠子宮、脾、胸腺指數(shù)及骨重和骨長(zhǎng)的影響 與OVX組比較，WEPO低劑量組和高劑量組小鼠子宮的重量顯著增加(P<0.001)、骨長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)；與OVX組相比，WEPO高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.001)；WEPO能夠改善OVX小鼠的骨重，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 小鼠子宮、胸腺、脾臟指數(shù)及骨重與骨長(zhǎng)

注：與SHAM組相比，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；與OVX組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3.3 WEPO對(duì)血清生化指標(biāo)的影響 表3為WEPO治療7周后不同組動(dòng)物血清生化指標(biāo)的結(jié)果。與SHAM組相比，OVX組小鼠ALP顯著升高，用WEPO治療后ALP均降低，WEPO高劑量組顯著降低(P<0.05)。與SHAM組相比，OVX組血清Ca水平顯著升高(P<0.05)，用WEPO治療后Ca水平略有降低，低劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與SHAM組相比，OVX組血清P水平升高，與OVX組相比，用WEPO治療后血清P水平降低，低劑量組有顯著性差異(P<0.01)。與SHAM組相比，OVX組小鼠血清TCHO水平顯著升高(P<0.05)，與OVX組相比，用WEPO治療后血清TCHO水平呈下降的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.4 WEPO對(duì)抗氧化指標(biāo)的影響 與SHAM組相比，OVX組肝組織中SOD水平顯著降低(P<0.01)，用LA或WEPO治療后小鼠肝組織中SOD水平均增加，且WEPO低劑量組與OVX組相比有顯著性差異(P<0.01)。OVX組MDA含量較SHAM組低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與OVX組相比，WEPO治療后MDA水平均降低，且WEPO高劑量組與OVX組相比有顯著性差異(P<0.01)，結(jié)果見表4。

3.5 WEPO對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的影響 與SHAM組相比OVX可見透明軟骨膜表面損壞、不光滑，軟骨細(xì)胞排列紊亂、有的部位可見大量浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞；與OVX組相比，在WEPO治療后可見透明軟骨膜修復(fù)較好，表面較光滑，軟骨細(xì)胞排列基本整齊，可見部分炎性細(xì)胞。

表3 血清ALP、Ca、P與TCHO水平的變化

注：與SHAM組相比，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；與OVX組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表4 肝勻漿SOD、MDA含量

注：與SHAM組相比，##P<0.01；與OVX組相比，**P<0.01

圖1 骨微結(jié)構(gòu)的變化[蘇木精-伊紅(HE)染色，×20]

3 討論

卵巢功能退化，體內(nèi)雌激素水平下降，雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨組織損傷及骨質(zhì)疏松主要誘因，多表現(xiàn)為骨量下降、骨脆性增加、骨代謝指標(biāo)的變化[15]。雌性小鼠的卵巢被切除以后，能夠較準(zhǔn)確地模擬婦女絕經(jīng)后高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松的骨丟失狀態(tài)以及對(duì)各種干預(yù)因素的反應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)采用去卵巢雌性小鼠模型，能夠準(zhǔn)確反映馬齒莧提取液對(duì)雌激素缺失狀態(tài)下改善骨代謝的作用。

小鼠去卵巢后，由于雌激素缺乏直接影響子宮的重量，子宮萎縮及體重(BW)增加被用作OVX成功的證據(jù)[17]。在本研究中，OVX小鼠顯示BW增加和子宮重量減少，證實(shí)手術(shù)成功。在WEPO治療后，BW降低，WEPO卻能維持正常子宮重量，提示W(wǎng)EPO能拮抗去勢(shì)造成的子宮質(zhì)量減輕[18]。OVX也誘導(dǎo)胸腺T和B細(xì)胞的增加，導(dǎo)致胸腺和脾臟重量增加，進(jìn)而導(dǎo)致更多的骨丟失[19]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用WEPO治療的OVX小鼠胸腺重量減少。另一項(xiàng)研究報(bào)道，OVX小鼠的骨量和長(zhǎng)度低于假手術(shù)小鼠[20]。在本研究中也證實(shí)了WEPO能夠改善OVX小鼠骨骼的重量和長(zhǎng)度。

骨是人體中鈣、磷的最大儲(chǔ)庫(kù)，通過成骨與溶骨作用不斷與細(xì)胞外液進(jìn)行鈣磷交換，以維持血鈣與血磷的平衡[21-23]。骨轉(zhuǎn)換標(biāo)記已被廣泛用作測(cè)量藥物對(duì)骨重塑的影響的工具[24]。 OVX小鼠的骨轉(zhuǎn)換增加[25]。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠去卵巢后，血清鈣磷水平增加，用WEPO 治療后有所降低，可提示W(wǎng)EPO可抑制骨吸收，降低骨質(zhì)疏松小鼠骨轉(zhuǎn)換率。ALP是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，通過分解磷酸酯的無(wú)機(jī)磷促進(jìn)基質(zhì)礦化，骨形成與ALP的活性高度相關(guān)，ALP是反映成骨細(xì)胞的重要標(biāo)志[21-23]。實(shí)驗(yàn)中OVX組小鼠血清ALP活性顯著升高，提示去卵巢小鼠骨代謝呈高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，一般認(rèn)為這種血清堿性磷酸酶活性的升高是伴隨著骨吸收亢進(jìn)而出現(xiàn)的代償性骨形成增強(qiáng)引起的[16]。雌激素可以調(diào)節(jié)膽固醇的代謝和沉積，卵巢切除后，雌激素水平下降，脂質(zhì)代謝紊亂，血漿總膽固醇升高[26-27]。用WEPO治療7周后降低了血清Ca、P和ALP水平，提示W(wǎng)EPO可以降低OVX誘導(dǎo)的高骨轉(zhuǎn)換率。

研究表明，雌激素水平下降，體內(nèi)活性氧增加，可能是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一[28]。馬齒莧總黃酮對(duì)氧自由基和羥基自由基都有良好的清除能力[9-11]，另外有研究表明馬齒莧總多糖具有顯著的體外抗氧化活性[12-14]。MDA是氧自由基引起脂質(zhì)過氧化的終末代謝產(chǎn)物，其含量反映了脂質(zhì)過氧化程度并間接反映氧自由基含量。在生理情況下，自由基的產(chǎn)生和清除過程維持著動(dòng)態(tài)平衡。如果自由基產(chǎn)生過多或清除不足，細(xì)胞就會(huì)受到損傷甚至死亡[26]。SOD主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，存在于肝細(xì)胞胞漿和線粒體，是重要的超氧陰離子清除劑，可減緩、抵御自由基損害，保護(hù)細(xì)胞。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WEPO可以有效調(diào)節(jié)OVX小鼠肝臟中MDA及SOD水平的變化， WEPO可能改善去卵巢小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡。

綜上所述，WEPO能夠改善骨代謝水平及機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，其效果與陽(yáng)性藥組相似，這些證據(jù)可提示馬齒莧可能是通過改善氧化應(yīng)激來(lái)改善骨代謝的。在所測(cè)定的指標(biāo)中BW、ALP和MDA等指標(biāo)呈劑量相關(guān)性，而血清Ca、P和SOD等指標(biāo)中則是低劑量組優(yōu)于高劑量組，其原因可能是由于給藥劑量的不同，藥物吸收程度不同，或者是由于藥物濃度不同，藥物成分間的相互影響程度不同[29]。馬齒莧來(lái)源廣，毒副作用小，價(jià)格便宜，具有廣闊的開發(fā)前景，但是其成分復(fù)雜，其作用機(jī)制可能與多種因素有關(guān)，確切的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。