中藥川楝子炮制前后總?cè)频暮孔兓芯?/h1>
2019-09-05 06:51崔乃華夏林波唐爽段新新鄧仕任
藥學(xué)研究 2019年8期
崔乃華，夏林波，唐爽，段新新，鄧仕任
(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)
川楝子(MeliatoosendanSieb.)，又名金鈴子，為楝科植物楝(MeliatoosendanSieb.et Zucc.)的干燥成熟果實(shí)[1]，具有疏肝瀉熱、殺蟲[2]、止痛[3]的功效?！吨袊?guó)藥典》2015年版收錄了川楝子生品和炒品[4]。川楝子生品有小毒，現(xiàn)代藥理研究表明其具有肌無(wú)力、抑制呼吸中樞等毒副作用[5]，故常將其炮制后入藥[6]，以達(dá)到“減毒增效”作用[7-8]。川楝素是目前公認(rèn)的川楝子中的特征毒性成分，當(dāng)前的炮制減毒研究多從川楝素的含量變化著手，而尚未見炮制對(duì)三萜類成分的整體含量變化的相關(guān)研究[9-12]。現(xiàn)已知，藥的藥效是多種成分共同作用實(shí)現(xiàn)的[13]，僅以川楝素這一種三萜成分含量變化作為其炮制機(jī)制的研究指標(biāo)，顯然是不全面、不充分的。本試驗(yàn)對(duì)川楝子炮制前后的總?cè)坪孔兓M(jìn)行研究，以期對(duì)為川楝子的炮制減毒機(jī)制進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)。
1 試驗(yàn)材料
1.1 試驗(yàn)藥品 川楝子飲片購(gòu)于河北省安國(guó)市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室王榮祥教授鑒定為楝科植物川楝(MeliatoosendanSieb.et Zucc.)的干燥成熟果實(shí)。川楝素對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：130320)。甲醇、高氯酸、冰乙酸、香草醛均為分析純。
1.2 試驗(yàn)儀器 FA1004B型精密電子天平(上海精密科學(xué)儀表有限公司)； DFT-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；ZDHW型電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。UV-1240型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；DHG202-0型電熱恒溫干燥箱。
2 試驗(yàn)方法與結(jié)果
2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取川楝素對(duì)照品10 mg，精密加入10 mL甲醇溶劑，制成1 mg·mL-1的川楝素對(duì)照品溶液備用。
2.2 供試品溶液制備 精密稱定本品粉末0.5 g于圓底燒瓶中，再精密加入甲醇25 mL，渦旋混勻后稱定重量，加熱回流1 h，冷卻至室溫后稱定重量，用甲醇溶劑補(bǔ)足損失的重量，搖勻，抽濾，即得。
2.3 川楝子炮制品制備 嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》2015年版中，炒川楝子項(xiàng)下的炮制方法進(jìn)行。平行炒制3份，分別命名為炮制品1、炮制品2、炮制品3。
2.4 測(cè)定波長(zhǎng)及顯色條件 精密吸取50 μL川楝素對(duì)照品甲醇溶液置于具塞試管中，水浴蒸干甲醇溶劑，精密加入0.8 mL高氯酸穩(wěn)定劑和0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸顯色劑，在60 ℃水浴中加熱15 min后，立即移入冰水浴，精密加入5 mL冰乙酸搖勻后置于室溫。取相應(yīng)的空白試劑校正基線后，于200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在515 nm處顯示最大吸收峰，所以樣品的測(cè)定波長(zhǎng)選擇515 nm。
2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取5份川楝素對(duì)照品溶液20、40、60、80、100 μL，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，以空白試劑校正基線，在波長(zhǎng)515 nm下分別測(cè)定吸光度，以吸光度Y對(duì)絕對(duì)量X(μg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.006 4X-0.001 2，R2=0.999 8；表明川楝素在20～100 μg范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。
2.6 精密度試驗(yàn) 精密取川楝子生品供試品溶液300 μL，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，在上述條件下連續(xù)測(cè)定6次，分別記錄吸光度值，吸光度平均值為0.353 0，RSD為1.64%，表明本法精密度良好，結(jié)果見表1。
表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果
2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密量取川楝子生品粉末6份，每份0.5 g,按“2.2”項(xiàng)下的方法分別制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算總?cè)坪科骄禐?.223 mg·g-1，RSD為0.54%，表明此法重復(fù)性良好，結(jié)果見表2。
表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取川楝子生品供試品溶液300 μL，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，置于室溫，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定各自吸光度，平均吸光度為0.358 0，RSD為1.87%，數(shù)據(jù)表明此供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。
2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的川楝子生品(9.223 mg·g-1)9份，每份大約0.25 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，每組精密加入低、中、高濃度的川楝素對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的方法以制備供試品溶液，在上述顯色條件下分析測(cè)定，結(jié)果表明該平均加樣回收率為99.8%，RSD=0.94%(n=9)，結(jié)果見表4。
表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.10 樣品含量測(cè)定 分別稱取生品和不同炮制品粉末各約0.5 g，分別按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液后，在上述顯色條件下分析，計(jì)算每個(gè)樣品中總?cè)频暮?，結(jié)果如表5所示。
表5 川楝子各樣品總?cè)坪?/p>
3 討論與總結(jié)
3.1 川楝子主產(chǎn)于我國(guó)南方各地，以四川省質(zhì)量最佳，為四川省道地藥材[14]。川楝子中主要活性成分川楝素具有驅(qū)蟲、抗肉毒作用，明代之后對(duì)川楝子的毒性均認(rèn)為有小毒[15]，是傳統(tǒng)的理氣中藥，關(guān)于川楝子的炮制方法，最早可追溯到南北朝時(shí)期的《雷公炮炙論》[16]所記述的酒蒸法，并提出“使肉既不使核，使核既不使肉”。宋至清代是川楝子炮制發(fā)展的鼎盛時(shí)期，發(fā)展了炒制、醋煮、酒浸、童子便浸、鹽炙、等炮制方法，近代在又新增了砂燙、烘制等方法，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》2015年版收錄的是清炒法,川楝子經(jīng)炮制后鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)顯著[17]，多炮制后使用，現(xiàn)代臨床上主要用來(lái)治療心痛、胸腹肋痛等。
3.2 總?cè)频暮繙y(cè)定多采取顯色法來(lái)進(jìn)行。在顯色過(guò)程中，文獻(xiàn)中大多采用熊果酸[18]作為對(duì)照品。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用熊果酸時(shí)，對(duì)照品顯色后的最大吸收波長(zhǎng)位于545 nm，而川楝子樣品的最大吸收波長(zhǎng)位于514～517 nm之間，上述結(jié)果表明熊果酸不適用于川楝子藥材的總?cè)坪繙y(cè)定，其原因可能在于川楝子中的三萜成分多為呋喃三萜類化合物，其結(jié)構(gòu)與熊果酸差異較大，因此顯色波長(zhǎng)不同?；谏鲜隹紤]，我們嘗試將對(duì)照品改為同為呋喃三萜結(jié)構(gòu)的川楝素后，發(fā)現(xiàn)對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移至515 nm，與實(shí)際樣品吻合度較好，故最終采用川楝素作為對(duì)照品。
3.3 本文首次報(bào)道川楝子中總?cè)坪繙y(cè)定方法以及川楝子生品和炮制品中總?cè)坪孔兓２捎肬V法[19]測(cè)定川楝子總?cè)坪繉?duì)精密度要求很高，試驗(yàn)操作過(guò)程要保證取樣量以及顯色劑的加入量必須精密準(zhǔn)確，否則試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差。通過(guò)方法學(xué)考察表明，本方法線性關(guān)系良好，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，可用于川楝子總?cè)坪繙y(cè)定。
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1 試驗(yàn)材料
1.1 試驗(yàn)藥品 川楝子飲片購(gòu)于河北省安國(guó)市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室王榮祥教授鑒定為楝科植物川楝(MeliatoosendanSieb.et Zucc.)的干燥成熟果實(shí)。川楝素對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：130320)。甲醇、高氯酸、冰乙酸、香草醛均為分析純。
1.2 試驗(yàn)儀器 FA1004B型精密電子天平(上海精密科學(xué)儀表有限公司)； DFT-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；ZDHW型電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。UV-1240型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；DHG202-0型電熱恒溫干燥箱。
2 試驗(yàn)方法與結(jié)果
2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取川楝素對(duì)照品10 mg，精密加入10 mL甲醇溶劑，制成1 mg·mL-1的川楝素對(duì)照品溶液備用。
2.2 供試品溶液制備 精密稱定本品粉末0.5 g于圓底燒瓶中，再精密加入甲醇25 mL，渦旋混勻后稱定重量，加熱回流1 h，冷卻至室溫后稱定重量，用甲醇溶劑補(bǔ)足損失的重量，搖勻，抽濾，即得。
2.3 川楝子炮制品制備 嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》2015年版中，炒川楝子項(xiàng)下的炮制方法進(jìn)行。平行炒制3份，分別命名為炮制品1、炮制品2、炮制品3。
2.4 測(cè)定波長(zhǎng)及顯色條件 精密吸取50 μL川楝素對(duì)照品甲醇溶液置于具塞試管中，水浴蒸干甲醇溶劑，精密加入0.8 mL高氯酸穩(wěn)定劑和0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸顯色劑，在60 ℃水浴中加熱15 min后，立即移入冰水浴，精密加入5 mL冰乙酸搖勻后置于室溫。取相應(yīng)的空白試劑校正基線后，于200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在515 nm處顯示最大吸收峰，所以樣品的測(cè)定波長(zhǎng)選擇515 nm。
2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取5份川楝素對(duì)照品溶液20、40、60、80、100 μL，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，以空白試劑校正基線，在波長(zhǎng)515 nm下分別測(cè)定吸光度，以吸光度Y對(duì)絕對(duì)量X(μg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.006 4X-0.001 2，R2=0.999 8；表明川楝素在20～100 μg范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。
2.6 精密度試驗(yàn) 精密取川楝子生品供試品溶液300 μL，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，在上述條件下連續(xù)測(cè)定6次，分別記錄吸光度值，吸光度平均值為0.353 0，RSD為1.64%，表明本法精密度良好，結(jié)果見表1。
表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果
2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密量取川楝子生品粉末6份，每份0.5 g,按“2.2”項(xiàng)下的方法分別制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算總?cè)坪科骄禐?.223 mg·g-1，RSD為0.54%，表明此法重復(fù)性良好，結(jié)果見表2。
表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取川楝子生品供試品溶液300 μL，按“2.4”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行顯色后，置于室溫，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定各自吸光度，平均吸光度為0.358 0，RSD為1.87%，數(shù)據(jù)表明此供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。
2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的川楝子生品(9.223 mg·g-1)9份，每份大約0.25 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，每組精密加入低、中、高濃度的川楝素對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的方法以制備供試品溶液，在上述顯色條件下分析測(cè)定，結(jié)果表明該平均加樣回收率為99.8%，RSD=0.94%(n=9)，結(jié)果見表4。
表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.10 樣品含量測(cè)定 分別稱取生品和不同炮制品粉末各約0.5 g，分別按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液后，在上述顯色條件下分析，計(jì)算每個(gè)樣品中總?cè)频暮?，結(jié)果如表5所示。
表5 川楝子各樣品總?cè)坪?/p>
3 討論與總結(jié)
3.1 川楝子主產(chǎn)于我國(guó)南方各地，以四川省質(zhì)量最佳，為四川省道地藥材[14]。川楝子中主要活性成分川楝素具有驅(qū)蟲、抗肉毒作用，明代之后對(duì)川楝子的毒性均認(rèn)為有小毒[15]，是傳統(tǒng)的理氣中藥，關(guān)于川楝子的炮制方法，最早可追溯到南北朝時(shí)期的《雷公炮炙論》[16]所記述的酒蒸法，并提出“使肉既不使核，使核既不使肉”。宋至清代是川楝子炮制發(fā)展的鼎盛時(shí)期，發(fā)展了炒制、醋煮、酒浸、童子便浸、鹽炙、等炮制方法，近代在又新增了砂燙、烘制等方法，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》2015年版收錄的是清炒法,川楝子經(jīng)炮制后鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)顯著[17]，多炮制后使用，現(xiàn)代臨床上主要用來(lái)治療心痛、胸腹肋痛等。
3.2 總?cè)频暮繙y(cè)定多采取顯色法來(lái)進(jìn)行。在顯色過(guò)程中，文獻(xiàn)中大多采用熊果酸[18]作為對(duì)照品。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用熊果酸時(shí)，對(duì)照品顯色后的最大吸收波長(zhǎng)位于545 nm，而川楝子樣品的最大吸收波長(zhǎng)位于514～517 nm之間，上述結(jié)果表明熊果酸不適用于川楝子藥材的總?cè)坪繙y(cè)定，其原因可能在于川楝子中的三萜成分多為呋喃三萜類化合物，其結(jié)構(gòu)與熊果酸差異較大，因此顯色波長(zhǎng)不同?；谏鲜隹紤]，我們嘗試將對(duì)照品改為同為呋喃三萜結(jié)構(gòu)的川楝素后，發(fā)現(xiàn)對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移至515 nm，與實(shí)際樣品吻合度較好，故最終采用川楝素作為對(duì)照品。
3.3 本文首次報(bào)道川楝子中總?cè)坪繙y(cè)定方法以及川楝子生品和炮制品中總?cè)坪孔兓２捎肬V法[19]測(cè)定川楝子總?cè)坪繉?duì)精密度要求很高，試驗(yàn)操作過(guò)程要保證取樣量以及顯色劑的加入量必須精密準(zhǔn)確，否則試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差。通過(guò)方法學(xué)考察表明，本方法線性關(guān)系良好，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，可用于川楝子總?cè)坪繙y(cè)定。
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