張璐 劉奇志 張國珍

摘要 由葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的梨輪紋病是梨生產(chǎn)中重要的真菌性病害，主要造成樹勢(shì)早衰和果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響梨的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究選取市售的6個(gè)品種的梨果實(shí)，用分離自梨枝干的輪紋病菌進(jìn)行了離體果實(shí)接種，測(cè)定不同品種果實(shí)對(duì)梨輪紋病的抗性差異。接種后6 d，按照病斑直徑從大到小的順序，品種排序依次為‘豐水梨>‘南果梨>‘庫爾勒香梨>‘皇冠梨>‘雪花梨>‘碭山酥梨，隨病斑減小抗性依次增強(qiáng)。測(cè)定了4種殺菌劑對(duì)梨輪紋病菌菌絲生長的抑制作用，結(jié)果表明，咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對(duì)梨輪紋病菌的菌絲生長有很強(qiáng)的抑制作用，EC50分別為0.010 3、0.022 4 μg/mL和0.034 3 μg/mL;代森錳鋅的EC50為3.860 7 μg/mL，也有較好的抑菌效果。本試驗(yàn)結(jié)果為了解不同梨品種對(duì)輪紋病的抗性及殺菌劑的選用提供了依據(jù)，具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 梨輪紋病; 品種抗性; 殺菌劑

中圖分類號(hào)： S 436.612.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018368

葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea是引起農(nóng)林業(yè)重要真菌病害的病原菌，在生態(tài)系統(tǒng)中占有重要的地位[1]。B.dothidea屬子囊菌門，葡萄座腔菌屬[2]。我國最早于1928年在遼寧省發(fā)現(xiàn)該病原菌引起蘋果輪紋病[3]。B.dothidea寄主廣泛，可侵染梨、蘋果、桃、李、杏、海棠、板栗、棗等至少45個(gè)屬的植物，導(dǎo)致木材品質(zhì)下降，花朵觀賞價(jià)值降低，水果質(zhì)量變差[47]。

我國是梨生產(chǎn)大國，梨種類繁多，栽培面積僅次于蘋果，梨果生產(chǎn)在我國占有重要的經(jīng)濟(jì)地位[8]。由B.dothidea引起的梨輪紋病是造成梨減產(chǎn)的重要病害。梨樹樹干、葉片、果實(shí)等部位均可被侵染，導(dǎo)致樹勢(shì)早衰、葉片干枯脫落、果實(shí)腐爛，尤其是貯藏期或多雨的年份，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)爛果率超過80%，造成無法挽回的損失[9]。近年來，梨輪紋病不僅在中國發(fā)生嚴(yán)重，在日本、韓國等周邊國家的發(fā)病率也逐年升高[10]。因此，有必要加強(qiáng)對(duì)梨輪紋病的相關(guān)研究。

利用抗病品種是防治植物病害的有效途徑之一。不同梨品種枝干或果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性存在差異。如山東地區(qū)種質(zhì)資源中‘金秋、‘毛杜梨和‘秋白梨較抗枝干輪紋病[11]。田路明等[12]采用幼果期無傷接種，比較了13份梨品種在果實(shí)成熟期和室溫貯藏期的輪紋病發(fā)生情況，表明不同品種果實(shí)對(duì)輪紋病抗性不同，室溫貯藏期的果實(shí)發(fā)病率較成熟期顯著提高。江蘇省的14個(gè)品種中，‘金水秋、‘晚三吉和‘碭山梨對(duì)果實(shí)輪紋病表現(xiàn)為抗病[9]。由此可見，基于自然發(fā)病條件下對(duì)梨品種果實(shí)抗輪紋病的測(cè)定易受環(huán)境條件的影響，在有利于果實(shí)輪紋病發(fā)生的時(shí)期接種，測(cè)定果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性能更好地反映品種間的抗性。

本研究分別從白梨系統(tǒng)、砂梨系統(tǒng)和秋子梨系統(tǒng)中選取不同代表品種，在實(shí)驗(yàn)室相對(duì)一致的可控條件下，測(cè)定了6種梨果對(duì)輪紋病的抗性差異，避免了田間環(huán)境多變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。同時(shí)，試驗(yàn)還測(cè)定了4種殺菌劑對(duì)輪紋病菌的抑菌作用。旨在為充分利用不同梨品種果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性以及為梨生產(chǎn)上選用有效的殺菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

輪紋病菌分離自2016年從北京市海淀區(qū)采集的表現(xiàn)典型輪紋病癥狀的梨樹樹干。

梨果實(shí)品種：白梨系統(tǒng)‘庫爾勒香梨、‘碭山酥梨和‘雪花梨;砂梨系統(tǒng)‘皇冠梨和‘豐水梨;秋子梨系統(tǒng)‘南果梨。梨果實(shí)均購自北京市海淀區(qū)的超市。

供試殺菌劑原藥：90%代森錳鋅、95.2%咯菌腈、97%氟啶胺和98.1%咪鮮胺，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室劉西莉教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離法對(duì)表現(xiàn)有瘤狀凸起病斑的梨輪紋病樹皮病樣進(jìn)行分離。在病健交界處取約5 mm見方的組織塊，在3.3% NaClO溶液中表面消毒1 min，用無菌蒸餾水漂洗3次，再用滅菌吸水紙吸干表面水分，置于PDA培養(yǎng)基上，25℃，光照培養(yǎng)。3 d后從病組織塊周圍長出的菌落邊緣挑取少量菌絲轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)，待病原菌產(chǎn)孢后，配制孢子懸浮液，采用單孢分離法獲得純化的單孢菌株。對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察

將純化的菌株B-8-1接種于PDA平板上，25℃，光照培養(yǎng)15 d，觀察菌落的顏色、形態(tài)、質(zhì)地以及氣生菌絲的生長情況，是否產(chǎn)生分生孢子等。

1.2.3 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

DNA提取：將菌株B-8-1接種于鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板，25℃，光照培養(yǎng)5 d，刮取菌落表面適量菌絲，采用CTAB法提取基因組DNA。

PCR擴(kuò)增及序列分析：用3對(duì)引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3′）、Bt-2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）/Bt-2b（5′-AC-CCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）和EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）分別對(duì)菌株B-8-1的rDNA-ITS、β-tubulin基因和EF1-α基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.4 梨果實(shí)接種

采用室內(nèi)離體接種法測(cè)定不同梨品種的果實(shí)對(duì)梨輪紋病的抗性差異。將菌株B-8-1于PDA平板上進(jìn)行活化，25℃，光照培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣打取直徑2 mm的菌塊用于接種。

選購市售的無傷、健康的6種梨果實(shí)，用75%乙醇表面消毒，無菌水沖洗3次，自然晾干，在每個(gè)果實(shí)的赤道部打1個(gè)直徑2 mm的小孔，接種梨輪紋病菌菌絲塊，以接種PDA培養(yǎng)基塊的處理為對(duì)照。每個(gè)處理接種10個(gè)果實(shí)。25℃，黑暗放置48 h后，在L∥D=12 h∥12 h光照黑暗交替條件下培養(yǎng)6 d，每24 h觀察1次發(fā)病進(jìn)程，6 d后測(cè)量病斑直徑。計(jì)算各品種梨果實(shí)病斑直徑平均值，評(píng)價(jià)各品種的抗性。

1.2.5 殺菌劑的毒力測(cè)定

采用菌絲生長抑制法測(cè)定殺菌劑對(duì)輪紋病菌菌株B-8-1的抑制作用。

用分析天平準(zhǔn)確稱量殺菌劑原藥分別放入5 mL保存管中，加入一定體積的二甲基亞砜（DMSO），在QL-901振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）上振蕩至藥劑充分溶解，配制成105 mg/L的母液，4℃黑暗保存?zhèn)溆谩?/p>

為確保所設(shè)置每種藥劑的濃度對(duì)輪紋病菌的抑制率處于5%～95%之間，90%代森錳鋅設(shè)置7個(gè)濃度梯度，分別為0.1、1.0、5.0、25.0、50.0、75.0 mg/L和100.0 mg/L;95.2%咯菌腈設(shè)置6個(gè)濃度梯度，分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 mg/L和0.1 mg/L;97%氟啶胺設(shè)置7個(gè)濃度梯度，分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L和1.0 mg/L;98.1%咪鮮胺設(shè)置7個(gè)濃度梯度，分別為0.000 5、0.002、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L和1.0 mg/L。

將藥液加入60℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中，制成系列濃度的含藥平板，以加入DMSO的培養(yǎng)基作為對(duì)照。在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，接種到含藥平板中央，每處理3次重復(fù)。25℃，黑暗培養(yǎng)。待對(duì)照菌落直徑長至約60 mm時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%;

數(shù)據(jù)處理：使用DPS 7.05數(shù)據(jù)分析軟件，將菌絲生長抑制率換算成幾率值（y），藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)（x），求得濃度對(duì)數(shù)與幾率值的線性回歸方程y=ax+b，并計(jì)算出藥劑對(duì)梨輪紋病菌的抑制中濃度（EC50）、幾率值和相關(guān)系數(shù)r。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株B-8-1在PDA培養(yǎng)基上25℃下培養(yǎng)，呈圓形輻射狀生長。菌絲體初期白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，氣生菌絲呈灰黑色，20 d左右菌落完全變?yōu)榘岛谏▓D1a和b）。在梨果實(shí)上產(chǎn)生黑色扁球形的分生孢子器（圖1c），從分生孢子器中釋放出無色、單胞、紡錘形或橢圓形、大小（24～30）μm×（6～8）μm的分生孢子（圖1d）。根據(jù)菌落形態(tài)和顏色、分生孢子顏色、大小、形狀等形態(tài)特征[1]，可將菌株B-8-1鑒定為葡萄座腔菌屬Botryosphaeria。

2.2 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

用3對(duì)引物ITS1/ITS4、Bt-2a/Bt-2b、EF1-728F/EF1-986R對(duì)菌株B-8-1的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到大小約為550、500和250 bp的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)菌株B-8-1的ITS序列與B.dothidea（登錄號(hào)為MG595271.1、KF516940.1、KC960911.1、JF800138.1、JF800137.1、GQ870286.1等）的相似性均為99%;β-tubulin基因的序列與B.dothidea（登錄號(hào)為KU565871.1、KR260833.1、KC961011.1、JF441078.1、HQ660476.1、KX281147.1等）的相似性為100%;EF1-α基因的序列與B.dothidea（登錄號(hào)為KC961067.1、KC961053.1、KC961047.1、KC961041.1、JQ900341.1、GU251233.1等）的相似性為100%。序列分析表明，菌株B-8-1為葡萄座腔菌B.dothidea。

2.3 不同品種梨果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性

用梨輪紋病菌菌株B-8-1接種健康梨果實(shí)引起果實(shí)腐爛發(fā)病。果實(shí)表皮組織最初變軟，然后以接種點(diǎn)為中心向外擴(kuò)展，病斑近圓形，水漬狀，最后變?yōu)闇\褐色、褐色或黑褐色大病斑;‘皇冠梨和‘雪花梨還伴有深淺相間的褐色同心輪紋（圖2a～f）。病部果肉腐爛伴有酸臭味。

從病斑大小看，不同品種果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性存在明顯差異?！S水梨病斑直徑最大，為49.7 mm，相對(duì)最為感病;其次為‘南果梨和‘庫爾勒香梨，病斑直徑分別為40.0 mm和36.1 mm;‘皇冠梨和‘雪花梨病斑直徑較小，分別為25.9 mm和24.4 mm;‘碭山酥梨病斑直徑最小，為15.1 mm，在所測(cè)試的6個(gè)品種中表現(xiàn)最為抗病。同一梨系統(tǒng)的不同品種對(duì)輪紋病的抗性也不相同，如砂梨系統(tǒng)的‘皇冠梨和‘豐水梨、白梨系統(tǒng)的‘庫爾勒香梨和‘碭山酥梨品種間的病斑大小有顯著差異，對(duì)輪紋病的抗性明顯不同（表1）。對(duì)照梨果均未發(fā)病，接種點(diǎn)表現(xiàn)為失水干縮或失水變褐（圖2a1～f1）。

2.4 殺菌劑對(duì)梨輪紋病菌的毒力測(cè)定

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，供試4種殺菌劑代森錳鋅、咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對(duì)梨輪紋病菌菌絲生長均具有較好的抑制作用。根據(jù)EC50，咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對(duì)梨輪紋病菌菌株B-8-1菌絲生長的抑制作用很強(qiáng)，代森錳鋅的抑制作用相對(duì)較弱，按照由強(qiáng)到弱依次為：咯菌腈>氟啶胺>咪鮮胺>代森錳鋅。4種殺菌劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)、EC50結(jié)果列于表2。

3 討論

梨輪紋病菌是一種弱寄生菌[14]。明確梨果品種間抗性，有利于對(duì)輪紋病的防控和梨果增產(chǎn)保質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)效益。李樹玲和黃禮森[15]對(duì)秋子梨、白梨和洋梨3個(gè)梨系統(tǒng)果實(shí)輪紋病在田間的自然發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)秋子梨系統(tǒng)的果實(shí)大部分抗病，‘南果梨最抗病;白梨和洋梨系統(tǒng)的果實(shí)大部分不抗病。曹玉芬等[16]采用噴霧接種法對(duì)梨樹上的幼果進(jìn)行接種，在成熟期鑒定了28個(gè)梨品種果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性，其中白梨系統(tǒng)最抗病，8個(gè)品種中有5個(gè)表現(xiàn)高抗或抗病;砂梨為中間類型，西洋梨最差。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同梨系統(tǒng)果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性有明顯差異，其中白梨系統(tǒng)的‘碭山酥梨抗性最強(qiáng)，砂梨系統(tǒng)的‘豐水梨抗性最差，秋子梨系統(tǒng)的‘南果梨不抗輪紋病。本試驗(yàn)結(jié)果與前人調(diào)查結(jié)果[1516]有出入，其原因可能與測(cè)定方法不同有很大關(guān)系。本試驗(yàn)采用的是室內(nèi)離體接種法，接種后溫濕度控制在一致的條件下，避免了外在環(huán)境因素多變而造成的影響。

有研究表明，梨品種的抗性差異可能與梨品種的成熟期早晚[9]、糖酸含量[17]等因素有關(guān)。趙梅等[18]發(fā)現(xiàn)果肉中石細(xì)胞和酚類物質(zhì)的含量與梨果對(duì)輪紋病的抗擴(kuò)展能力呈正相關(guān)。梨品種所表現(xiàn)出的抗病性，除自身組織結(jié)構(gòu)外，是否存在相關(guān)抗性基因，是否與相關(guān)基因表達(dá)的產(chǎn)物有關(guān)[7]，還需更深入的研究來進(jìn)一步證明。

傳統(tǒng)上多用波爾多液、石硫合劑等無機(jī)殺菌劑防治梨輪紋病，后來出現(xiàn)了多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑。但近些年隨著病原菌抗藥性的產(chǎn)生，很多藥劑的藥效逐年降低[7， 19]。有結(jié)果表明，25%吡唑醚菌酯乳油和80%戊唑醇可濕性粉劑均為防治梨輪紋病較為理想的低毒、低殘留、持效期長的內(nèi)吸治療性殺菌劑，田間噴灑時(shí)不僅可殺死植株表面的病原菌，還可被植株迅速吸收傳導(dǎo)至體內(nèi)發(fā)揮作用[2022]。本試驗(yàn)測(cè)定了有機(jī)硫類的代森錳鋅、二硝基苯胺類的氟啶胺、吡咯類的咯菌腈和酰胺類的咪鮮胺4種殺菌劑對(duì)輪紋病菌菌絲生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)氟啶胺、咪鮮胺和咯菌腈均有很好的抑菌作用。試驗(yàn)結(jié)果為梨輪紋病的化學(xué)防治提供了候選藥劑，也為藥劑的輪換使用提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）