王玉靈 郭致杰 胡冠芳 李國鋒 牛樹君 趙峰

摘要 本文采用MCI柱層析、硅膠柱層析等天然產(chǎn)物分離方法，從唐古特莨菪地上部甲醇粗提物中分離得到了2個莨菪烷類生物堿單體。通過化合物特征反應(yīng)，質(zhì)譜、碳譜和氫譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合相關(guān)文獻報道鑒定了其結(jié)構(gòu)，分別為樟柳堿和山莨菪堿。采用微量點滴法和玻片浸漬法測定了2種生物堿對甘藍蚜等6種常見蚜蟲和朱砂葉螨等4種常見葉螨處理24 h的觸殺活性，結(jié)果表明，樟柳堿對豆蚜、棉蚜、麥長管蚜和山莨菪堿對棉蚜具有較強的觸殺活性，處理24 h的LC50依次為0.495、0.429、0.881和0.404 mg/mL，其活性均高于對照藥劑魚藤酮或與其相當，相對毒力分別為魚藤酮的1.246、1.017、1.168和1.078倍;樟柳堿對朱砂葉螨、二斑葉螨和山莨菪堿對朱砂葉螨、二斑葉螨具有較強的觸殺活性，處理24 h的LC50依次為0.484、0.446和0.331、0.430 mg/mL，其活性均高于魚藤酮，相對毒力分別為魚藤酮的1.136、1.154和1.662、1.198倍。

關(guān)鍵詞 唐古特莨菪; 莨菪烷類生物堿; 分離鑒定; 殺蟲活性

中圖分類號： S 482.3

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018330

生物堿是自然界中廣泛存在的一大類堿性含氮化合物，具有廣泛的生理活性[1]，往往是許多中草藥及藥用植物的有效成分[2]。生物堿的發(fā)現(xiàn)起始于19世紀初，是人們研究最早且最多的一類天然有機化合物，迄今為止，從植物中分離出的生物堿大約有5 000多種[3]，《全國醫(yī)藥產(chǎn)品大全》收載的生物堿藥物及其制劑有62種，臨床應(yīng)用的生物堿也有80余種[4]。由于諸多生物堿具有抗腫瘤、抗菌、低毒性和成本低的特性，因而受到人們極大的關(guān)注[56]。在植物源農(nóng)藥的研制中，生物堿作為極具開發(fā)潛質(zhì)的一個大類而被廣泛重視和應(yīng)用[7]。截至目前，一些生物堿因具有殺蟲抑菌等活性而被開發(fā)為農(nóng)藥產(chǎn)品，如煙堿（nicotine）、苦參堿（matrine）、喜樹堿（camptothecin）、小檗堿（berberine）、百部堿（stemonine）及藜蘆堿（veratrine）[8]等。

唐古特莨菪Anisodus tanguticus （Maxim.） Pascher是我國特有的一種茄科Solanaceae山莨菪屬Anisodus多年生草本高山植物，主要分布于青海、西藏以及四川和甘肅的部分地區(qū)，在藏藥和中草藥領(lǐng)域研究應(yīng)用較廣[912]。近年來，隨著對唐古特莨菪有效成分研究的不斷深入，認識到莨菪烷類生物堿化合物是唐古特莨菪中主要的生物活性成分。莨菪烷類生物堿在臨床上具有抗膽堿、麻醉、活血化瘀等多種功效[5，6，13]，但其作為農(nóng)藥活性分子的研究報道甚少。張興等[14]、張國洲等[15]、胡冠芳等[16]研究了唐古特莨菪對赤擬谷盜Tribolium castaneum、菜青蟲Pieris rapae、黏蟲Mythimna separata、

麥長管蚜Sitobion miscanthi等害蟲的生物活性，但只停留在粗提物階段，尚未涉及活性化合物單體研究。鑒于此，作者前期結(jié)合活性示蹤，從唐古特莨菪地上部分甲醇粗提物中分離獲得了2個莨菪烷類生物堿化合物單體，分別為莨菪堿hyoscyamine和東莨菪堿scopolamine，并測定了其殺蚜、殺螨活性，結(jié)果顯示，莨菪堿對豆蚜Aphis craccivora、禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi、桃蚜Myzus persicae和棉蚜A.gossypii具有較強的觸殺活性，東莨菪堿對豆蚜和禾谷縊管蚜具有較強的觸殺作用;莨菪堿和東莨菪堿對截形葉螨Tetranychus truncatus、山楂葉螨Amphitetranychus viennensis、二斑葉螨T.urticae和朱砂葉螨T. cinnabarinus具有較強的觸殺作用，2種生物堿對4種葉螨的毒力相當，均表現(xiàn)出對二斑葉螨和朱砂葉螨的毒力高于截形葉螨和山楂葉螨[1718]。

基于莨菪堿和東莨菪堿對蚜蟲和葉螨具有較強的觸殺活性，本課題組對唐古特莨菪中的生物堿進行了再次分離鑒定，以期得到更多的生物堿單體，為進一步完善莨菪烷類生物堿活性數(shù)據(jù)，指導(dǎo)莨菪烷類生物堿結(jié)構(gòu)優(yōu)化與衍生物合成，發(fā)現(xiàn)活性更強的新化合物，創(chuàng)制新型高效、低毒、低殘留植物源農(nóng)藥提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 活性成分分離鑒定

1.1.1 供試材料、試劑與儀器

供試材料：唐古特莨菪于2016年7月中旬采自甘南藏族自治州臨潭縣海拔為3 420 m的天然草地。取其地上部莖、葉及青果（未成熟果實），洗凈切碎，自然陰干，粉碎過40目篩，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑與儀器：魚藤酮（rotenone）、樟柳堿（anisodine）、山莨菪堿（anisodamine）標準品購于百靈威科技有限公司。柱層析硅膠（48～75 μm）、薄層層析硅膠（GF254）、小孔樹脂凝膠MCI CHP 20P（75～150 μm）均由青島海洋化工廠生產(chǎn)。乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為分析純。BrukerAPEXⅡ質(zhì)譜儀和BrukerDRX400核磁共振波譜儀，由德國Bruker公司生產(chǎn);ZF7c三用紫外分析儀，由上海康華生化儀器制造有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 活性成分提取與分離方法

稱取2.2 kg唐古特莨菪植物粉末，用甲醇浸提3次（時間依次為72、48、24 h），合并濾液，減壓濃縮至膏狀，懸浮于蒸餾水中，用4 mol/L HCl調(diào)懸浮液pH=1～2，靜置過夜，抽濾，再用4 mol/L NaOH調(diào)懸浮液pH=9～10，靜置過夜，用氯仿等體積萃取，減壓濃縮，回收氯仿，得到唐古特莨菪總生物堿150 g。

將150 g總生物堿用MCI柱（填料約3.5 L樹脂）層析，用甲醇∶乙腈∶水（16∶4∶80、26∶4∶70、36∶4∶60、46∶4∶50）依次洗脫，薄層檢測并收集相同流段，共得到A、B、C、D 4個組分，參照標準品，發(fā)現(xiàn)生物堿成分存在于B、C組分內(nèi)。

將B組分浸膏25.3 g硅膠柱層析，用氯仿甲醇（含1‰三乙胺）梯度（40∶1、30∶1、20∶1、10∶1）洗脫，后用甲醇沖柱。以每1 000 mL的流出液作為分段，每個分段蒸除溶劑后用薄層層析硅膠板檢測，合并TLC顯示結(jié)果一樣或者相近的流段，共得到5個組分：B-Fr1（40∶1）、B-Fr2（30∶1）、B-Fr3（30∶1～20∶1）、B-Fr4（20∶1～10∶1）、B-Fr5（氯仿、甲醇沖柱）。將組分B-Fr3（氯仿∶甲醇=30∶1～20∶1，約6.7 g）用丙酮石油醚（1∶1）溶解，用硅膠濕法拌樣柱層析，用石油醚丙酮（含2%氨水）梯度（8∶1、4∶1、2∶1、1∶1）洗脫，得到4個組分：B-Fr3-1、B-Fr3-2、B-Fr3-3、B-Fr3-4，將B-Fr3-2（2.1 g）用硅膠濕法拌樣，以石油醚∶丙酮（2∶1，1∶1，0.5∶1）梯度洗脫，得化合物2。

將C組分浸膏19.5 g用硅膠濕法上柱，氯仿甲醇（含1‰三乙胺）梯度（30∶1，20∶1，10∶1）洗脫，后用甲醇沖柱。以每1 000 mL流出液作為分段，每個分段蒸除溶劑后用薄層檢測，將TLC顯示結(jié)果一樣或者相近的流段合并，共得到4個組分：C-Fr1（30∶1）、C-Fr2（20∶1）、C-Fr3（20∶110∶1）、C-Fr4（10∶1）。將組分C-Fr3（氯仿∶甲醇=5∶1，約6.1 g）用氯仿甲醇（10∶1）溶解，用硅膠濕法拌樣柱層析，用氯仿甲醇（含2%氨水）梯度（20∶1，10∶1，5∶1，2.5∶1）洗脫，依據(jù)TLC檢測得到4個組分：C-Fr3-1、C-Fr3-2、C-Fr3-3、C-Fr3-4，將C-Fr3-2（3.2 g）用硅膠濕法拌樣，以反向硅膠柱進行層析純化，在甲醇水條件下進行梯度（10∶1，5∶1，2.5∶1）洗脫，得化合物4。

1.2 殺蚜殺螨活性測定

1.2.1 供試蚜蟲與葉螨

甘藍蚜Brevicoryne brassicae、麥長管蚜S.miscanthi、豆蚜A.craccivora、禾谷縊管蚜R.padi、桃蚜M.persicae和棉蚜A.gossypii分別采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院不施藥的甘藍Brassica oleracea田、小麥Triticum aestivum田、蠶豆Vicia faba田、玉米Zea mays田、油菜Brassica napus田和棉花Gossypium hirsutum田。朱砂葉螨T.cinnabarinus、二斑葉螨T.urticae、截形葉螨T.truncatus及山楂葉螨Amphitetranychus viennensis分別采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院不施藥的大豆Glycine max、菜豆Phaseolus vulgaris、桃樹Prunus persica或蘋果樹Malus pumila葉片上。

1.2.2 供試藥劑濃度設(shè)置

樟柳堿、山莨菪堿和對照藥劑魚藤酮均用丙酮水（9∶1）溶解，并加入1%表面活性劑JFC（C7～C9烷醇聚氧乙烯醚）。依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，將樟柳堿、山莨菪堿測定濃度在166.7～4 000.0 mg/L之間設(shè)置5個不同梯度濃度。溶劑對照及藥劑對照均按處理的同等梯度濃度設(shè)置。

1.2.3 殺蚜殺螨活性測定方法

對蚜蟲的觸殺作用測定參照已報道的權(quán)威經(jīng)典測試方法—點滴法[19]。挑選大小一致的無翅成蚜，用0.046 μL的微量點滴器將藥液點滴在蚜蟲的前胸背板上，置于已放入新鮮寄主植物葉片并鋪有濾紙保濕的直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，每皿放30頭蚜蟲，每個濃度重復(fù)3次。以等量的丙酮水+JFC用蒸餾水稀釋成同樣濃度作為溶劑對照，以相同方法配制不同濃度梯度的魚藤酮作為藥劑對照。在溫度（25±1）℃、濕度60%～80%、L∥D=14 h∥10 h條件下飼養(yǎng)，24 h后檢查死亡數(shù)，計算死亡率、校正死亡率及相對毒力。用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸及方差分析，得毒力回歸方程（Y=A+BX），致死中濃度LC50及95%置信限。

死亡率=（死亡蟲數(shù)/處理蟲數(shù)）×100%;

校正死亡率=[（處理死亡率-對照死亡率）/（100-對照死亡率）]×100%;

相對毒力=對照藥劑的LC50/供試藥劑的LC50。

對葉螨的觸殺作用測定采用FAO推薦的玻片浸漬法[20]。用毛筆挑選大小一致、體色鮮艷、行動活潑的雌成螨，將其背部粘在載玻片一端的雙面膠帶上（保證螨足、螨須和口器可自由活動），每片粘30頭。在溫度（25±1）℃、濕度60%～80%、L∥D=14 h∥10 h條件下飼養(yǎng)，及時加水保濕，4 h后用雙目鏡觀察，剔除死亡或不活潑個體。將帶螨玻片的一端浸入藥液中，輕輕搖動5 s后取出，用吸水紙迅速吸干螨體及其周圍多余的藥液，每個濃度重復(fù)3次。處理后將試螨置于上述條件的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用雙目鏡調(diào)查死亡數(shù)，計算死亡率、校正死亡率及相對毒力。計算公式及分析方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

化合物2，無色針狀晶體，經(jīng)改良碘化鉍鉀溶液后顯色，表明該化合物可能為生物堿類。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.31～7.40（5H，m，Ar-H），5.04（1H，t，H-3），4.19（1H，m，H-11α），3.79（1H，m，H-11β），3.38（1H，d，J=4.8 Hz，H-5），3.13（1H，m，H-1），3.11（1H，m，H-7），2.46（3H，s，NCH3），2.17（2H，m，H-4α），2.00～2.07（1H，m，H-6），2.05（1H，m，H-2α），1.60（1H，d，J=15.2 Hz，H-4β），1.36（1H，d，J=15.6 Hz，H-2β）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：174.2（C-9），136.7（C-12），128.4（2C，C-14，C-16），128.1（2C，C-13，C-17），126.59（C-15），82.1（C-10），69.5（C-11），68.0（C-3），59.7（2C，C-1，C-5），55.2（C-6），54.6（C-7），33.3（C-8），29.7（C-4），25.9（C-2）.Anal.calcd.for C17H21NO4：C，63.94，H，6.63;N，4.39.Found：C，64.00;H，6.60;N，4.42.ESI-MS m/z：320.35[M+H]+。依據(jù)文獻及譜圖分析結(jié)果，確定化合物2為樟柳堿[21]。

化合物4，無色針狀晶體，經(jīng)改良碘化鉍鉀溶液后顯色，表明該化合物可能為生物堿類。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.32～7.43（5H，m，Ar-H），4.99（1H，m，H-3），4.26（1H，m，H-6），4.18（1H，m，H-10），3.85（2H，m，H11α），3.37（1H，m，H-1），3.11（1H，d，J=2.4 Hz，H-5），2.46（3H，s，NCH3），2.29（1H，m，H-4α），2.07（1H，m，H-2α），1.70（1H，d，J=16.0 Hz，H-4β），1.53（1H，m，H-2β）.13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：175.3（C-9），137.6（C-12），131.6（2C，C-14，C-16），130.6（2C，C-13，C-17），129.5（C-15），72.6（C-6），71.6（C-5），67.5（C-3），64.4（2C，C-1，C-11），56.0（C-10），42.7（C-8），36.8（C-7），36.5（C-2），35.2（C-4）;Anal.calcd.for C17H23NO4：C，66.86;H，7.59;N，4.59.Found：C，67.00;H，7.55;N，4.62.ESI-MS m/z：306.24[M+H]+。依據(jù)文獻及譜圖分析結(jié)果，確定化合物4為山莨菪堿[22]。

2.2 殺蚜殺螨活性測定結(jié)果

毒力測定結(jié)果（表1）表明，樟柳堿對豆蚜、棉蚜、麥長管蚜具有較強的觸殺活性，其LC50依次為0.495、0.429、0.881 mg/mL，其活性稍高于魚藤酮或與其相當（0.617、0.436、1.030 mg/mL），相對毒力分別為魚藤酮的1.246、1.017、1.168倍。樟柳堿對甘藍蚜、禾谷縊管蚜和桃蚜的觸殺活性不及魚藤酮。山莨菪堿對棉蚜的觸殺活性（0.404 mg/mL）與魚藤酮相當，相對毒力為魚藤酮的1.078倍，對甘藍蚜、禾谷縊管蚜、桃蚜、豆蚜和麥長管蚜的觸殺活性低于魚藤酮。

毒力測定結(jié)果表明（表2），樟柳堿對朱砂葉螨、二斑葉螨具有較強的觸殺活性，LC50為0.484、0.446 mg/mL，其活性稍高于魚藤酮，相對毒力為魚藤酮的1.136、1.154倍。山莨菪堿對朱砂葉螨、二斑葉螨的觸殺活性（0.331、0.430 mg/mL）高于魚藤酮，相對毒力分別為魚藤酮的1.662、1.198倍。2種生物堿對截形葉螨和山楂葉螨的毒力均低于魚藤酮。

3 結(jié)論與討論

本研究借鑒項目組前期從唐古特莨菪中分離獲得2種生物堿化合物（莨菪堿和東莨菪堿）并發(fā)現(xiàn)其具較強殺蚜殺螨活性的思路及方法，繼續(xù)分離并表征了2種生物堿結(jié)構(gòu)，分別為山莨菪堿和樟柳堿。以同樣來源于植物（豆科Leguminosae魚藤屬Derris等植物）的魚藤酮為藥劑對照，通過測定2種生物堿對甘藍蚜等6種蚜蟲和朱砂葉螨等4種葉螨的觸殺活性，發(fā)現(xiàn)樟柳堿對豆蚜、棉蚜、麥長管蚜以及朱砂葉螨和二斑葉螨具有較強的觸殺活性，LC50在0.429～0.881 mg/L之間;山莨菪堿對棉蚜以及朱砂葉螨和二斑葉螨也具有較強的觸殺活性，LC50在0.331～0.430 mg/L之間，2種生物堿對供試蚜蟲和葉螨的活性均稍高于對照藥劑魚藤酮或與其相當。

莨菪烷類生物堿是含莨菪烷骨架且生理活性很強的一類天然產(chǎn)物化合物，人工合成之衍生物數(shù)量也較多，但有關(guān)其活性的研究偏重于醫(yī)藥、植物化學(xué)等領(lǐng)域[13，23]。關(guān)于莨菪烷類生物堿的農(nóng)藥活性，作者報道過莨菪堿、東莨菪堿的殺蚜殺螨活性[17]，結(jié)合本文對山莨菪堿和樟柳堿的殺蚜殺螨活性研究結(jié)果，總體認為這4種生物堿具有較強的殺蚜殺螨活性，且對有些蚜蟲和葉螨的活性高于魚藤酮，為利用莨菪烷類生物堿創(chuàng)制新農(nóng)藥提供了線索和新思路。但其在農(nóng)藥上的應(yīng)用可能會因原料來源而受到限制，其化學(xué)合成在經(jīng)濟上可行性不強，因此這些化合物在農(nóng)藥上能否商業(yè)化很大程度上還取決于它們在茄科植物中的含量及分離程度。今后的研究方向是：1）開展三維定量構(gòu)效關(guān)系研究指導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和衍生合成，通過農(nóng)藥生物活性測定篩選出高活性化合物，結(jié)合高活性化合物的作用機理研究，為創(chuàng)制新農(nóng)藥提供技術(shù)支撐和理論依據(jù);2）用生物反應(yīng)器替代植物自身生產(chǎn)系統(tǒng)，即擴增、克隆莨菪烷生物堿生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵性基因序列，導(dǎo)入替代生物反應(yīng)器，甚至通過基因過表達來指導(dǎo)生物堿的高效生產(chǎn)。

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（責任編輯：楊明麗）